Bremañ†Chomlec'h bremañ : OX11 0DE, Rouantelezh-Unanet, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Rouantelezh-Unanet, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Ar c'hemplezh 1 (RC-LH1) a zastum gouloù er greizenn reaktadur eo elfenn fotosintetek diazez ar bakteri fototrofek mouk. Kinniget hon eus daou framm mikroskopiezh krio-elektronek eus ar c'hemplezh RC-LH1 eus Rhodopseudomonas palustris. Ar framm 2,65-Å eus ar c'hemplezh RC-LH114-W a zo savet diwar 14 boukl LH1 isunanenn tro-dro da RC, a vez termenet gant ar protein W, tra ma'z eo ar c'hemplezh hep protein-W ur c'hefluniadur RC penn-da-benn en-dro da RC. Boukl LH1 16 isunanenn serret. Keñveriañ ar frammoù-se a ginnig titouroù diwar-benn emdroadur ar c'hinon er c'hemplezh RC-LH1, en o zouez kemmoù stumm na oant ket bet termenet a-raok pa vez staget ar c'hinon ouzh al lec'h RC QB, hag ivez lec'hiadur al lec'hioù liammañ kinon skoazell, a sikour da dreuzkas anezho da RC. Struktur dibar ar protein W a vir ouzh serriñ ar boukl LH1, o krouiñ dre-se ur chadenn evit buanaat an eskemm kinon/kinon.
An energiezh pourvezet gant ar fotosintez a c'hell derc'hel tost an holl vuhez war an douar, ha barregezh bras he deus evit bioteknologiezh an heol. E-keit ma vez brudañ ar fotosintez hollek e tiskouez ar bakteri fototrofek mouk ivez doareoù energiezh ha barregezhioù metabolek liesseurt. Gallout a reont diwall ouzh ar fotosintez ha kreskiñ evel bakteri heterotrof en deñvalijenn, gallout a reont fiziañ azot ha dioksidenn garbon, produiñ hidrogen ha distrujañ ar c'hevanadoù aromatek (1-3). Evit pourchas energiezh d'an argerzhioù-se e rank ar gouloù bezañ treuzfurmet buan ha reizh en energiezh kimiek. Kregiñ a ra an argerzh-se pa vez lonket ar gouloù gant ar c'hemplezh antenn-dapout gouloù ha pa vez treuzkaset an energiezh dalc'het d'ar greizenn reaktadur (RC), ha dre-se e krog an disparti kargoù (4 – 7). Unanenn diazez ar fotosintez e bakteri fototrofek mouk a zo savet diwar RC doare 2, kelc'hiet gant kemplezh dastum gouloù 1 (LH1), o sevel kemplezh diazez RC-LH1. Savet eo LH1 gant un toullad heterodimeroù αβ kromm, pep hini anezho a liamm daou volekulenn klorofil bakteriel (BChl) a hag unan pe daou garotenoid (8-12). An antenn LH1 simplañ a ya d'ober 16 pe 17 heterodimer αβ en-dro da RC (9-13) en ur boukl serr, met e kemplezhoù diazez all e vez troc'het kendalc'h an LH1 tro-dro gant peptidoù treuzmembranek, ha dre-se e vez broudet an treuzfurmadur kinol/kinon etre RC ha kemplezh sitokrom bcc (1111). Ar plant fototrofek limestra Rhodopseudomonas (Rps.) zo un organeg skouer a c'hell kompren an energiezh hag an treuzkas elektronoù a skoazell ar fotosintez. Ar framm kristal kentañ a Rps. RC eo patrom ar c'hemplezh palustris RC-LH1, kelc'hiet gant 15 boukl LH1 heterodimerek, a vez troc'het gant ur protein dianav anvet "Protein W" (14). Anavezet e voe ar protein-W da c'houde evel RPA4402, hag a zo ur protein 10,5kDa dizimez gant teir heliks treuzmembranek rakwelet (TMH) (16). Kinnig a reomp adlakaat anv ar gen rpa4402 a enrineg ar protein W da pufW evit bezañ kempoell gant an anvadur implijet evit ar genoù a enrinegañ isunanennoù RC-L, M (pufL, pufM) ha LH1α, β (pufA, pufB). Dedennus eo, n'eus protein-W nemet e war-dro 10% eus RC-LH1, ar pezh a ziskouez Rps. palustris a brodu daou gemplezh RC-LH1 disheñvel. Amañ e kinnigomp frammoù krio-EM (krio-EM) uhel o diarunusted eus daou gemplezh diazez, unan gant protein W ha 14 heterodimer αβ, egile hep protein W hag ur boukl 16 Heterodimer LH1 serr. Ar framm a zastum ur cheñchamant tamm-ha-tamm e kompren ar c'hemplezh RC-LH1 eus Rps. palustris, rak dielfennet hon eus poblañs heñvel pep stumm hag hon eus disoc'h a-walc'h evit termeniñ sklaer pep peptid ha pigmantoù liammet ha lipidoù ha kinonoù liammet outo. Keñveriañ ar frammoù-se a ziskouez e krou an teir protein TMH-W n'int ket bet kavet e kemplezh RC-LH1 all ebet betek-henn ur ganol kinon evit buanaat an eskemm kinon/kinon. Un toullad lec'hioù stagañ lipidoù ha kinonoù miret zo bet anavezet, ha diskuliet hon eus ur c'hemm stumm nevez goude ar c'hevreadur kinon ha RC, a c'hellfe bezañ dereat evit fotoreizhiad II (PSII) RC an organegoù fototrofek oksigenet. Ar pezh hon eus kavet a ginnig titouroù nevez diwar-benn kinetik al liammañ hag an eskemm kinon/kinolon e kemplezh diazez RC-LH1 ar bakteri fototrofek mouk.
Evit aesaat ur studiadenn dre ar munud eus an daou gemplezh a gaver e Rps. palustris, e tizoloomp pep RC-LH1 dre doareoù biokimiek. Ar c'hemplezh hep protein W (anvet ΔpufW da c'houde) a oa bet puraet diwar ar spesad hep ar gen pufW (16), ha n'eus nemet ur c'hemplezh RC-LH1 a c'haller produiñ. Produet e vez ar c'hemplezh protein W ennañ gant ur spesad. Kemmet eo ar protein W eus ar spesad-mañ gant un dikedenn 10x His en e C-terminus, evit ma c'hallfe ar c'hemplezh ennañ protein W bezañ kendeuzet en un doare efedus gant an darn vrasañ eus ar protein W a vank dezhañ dre zilec'hiañ ar metal. Dispartiet eo ar c'hemplezh en un doare efedus (16) Kromatografiezh dre zarempred (IMAC).
Evel m'eo diskouezet e skeudenn 1, an daou gemplezh a endalc'h un RC teir is-unvez (RC-L, RC-M ha RC-H) kelc'hiet gant un antenn LH1. Ar framm 2.80-A eus ar c'hemplezh hep protein-W a ziskouez 16 heterodimer αβ, o sevel ur boukl LH1 serr tro-dro da RC penn-da-benn, anvet amañ ar c'hemplezh RC-LH116. Ar framm 2,65Å eus ar c'hemplezh ennañ protein-W en deus un LH1 14-heterodimer troc'het gant protein-W, anvet RC-LH114-W amañ da c'houde.
(A ha B) Diskouezadur gorre ar c'hevanaoz. (C ha D) Ligmantoù liammet eztaolet e barrennoù. (E ha F) Ar c'hemplezhioù a vez gwelet diwar gorre ar sitoplazmek o deus ar peptidoù hag an isunanennoù LH1 a vez diskouezet er bannoù-treset, hag a zo niveret e tu an eurier diouzh ar c'heflusker protein-W [kempoell gant niverennadur Rba. sphaeroides complex (13)]. Evit LH1-α eo melen liv an isunanenn protein ; evit LH1-β eo glas liv an isunanenn protein ; evit ar protein-W eo ruz ar protein ; evit RC-H, sian eo ; evit RC-L eo orañjez ; evit RC-M, magenta. Ar c'hofaktoroù a vez diskouezet gant barrennoù, ar gwer a arouez ar molekulennoù BChl ha BPh a, ar gwer a arouez ar c'harotenoidoù, hag ar melen a arouez ar molekulennoù UQ10. (G ha H) Gwel brasaet ar c'heflusker protein-W e rannvro kevatal ar c'hemplezh RC-LH114-W (G) hag ar c'hemplezh RC-LH116 (H). Diskouezet e vez ar c'hofaktoroù e stumm leuniañ an egor, diskouezet e vez ar c'hinon kelatet e glas. Sklêrijennet eo ar c'heflusker protein-W gant ul linenn strizh glas e (G), hag an toulloù bihan ma vez skignet ar c'hinon/kinolol war ar walenn LH116 a zo diskouezet gant ul linenn strizh du e (H).
Ar skeudenn 1 (A ha B) a ziskouez an RC kelc'hiet gant strolladoù digor pe serr a heterodimeroù LH1αβ, pep hini anezho a liamm daou BChl hag ur c'harotenoid (Skeudenn 1, C ha D). Studioù kent o deus diskouezet eo Rps ar c'hemplezh LH1. E hent biosintetek ar spirulina xanthin e kaver er spesadoù-se poblañsoù mesket a garotenoidoù (17). Koulskoude, ar spiropiroksantin eo ar c'harotenoid pennañ hag e stankter a zo dereat. Dre-se hon eus dibabet modelañ ar spiroxantin en holl lec'hioù liammañ LH1. Ar polipeptidoù alfa ha beta a zo TMHoù unvan gant rannvroioù diavaez berr ar grogenn (Skeudenn 1, A, B, E, ha F). Daoust ma ne oa ket bet gwelet stankter 17 dilerc'h er penn-C, e oa bet rannet ar polipeptid alfa eus Met1 da Ala46 en daou gemplezh. β polipeptid a oa bet digresket eus Gly4 da Tyr52 e RC-LH116, hag eus Ser5 da Tyr52 e RC-LH114-W. Ne oa bet gwelet stankter ebet eus 3 pe 4 restach N-termen pe 13 C-termen (Skeudenn S1). An analizenn dre spektrometriezh tolz eus ar c'hemplezh RC-LH1 mesket prientet diwar ar spesad gouez a ziskouezas e oa ar rannvro mankout disoc'h troc'h heterologel ar peptidoù-se (Skeudenn S1 ha S2). Gwelet e voe ivez ar formiladur N-termenel eus α-Met1 (f). An dielfennadur a ziskouezas e oa ar peptid α savet diwar restachoù fMet1 betek Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, hag ar peptid β diwar restachoù Ser2 betek Ala53, ar pezh a glot mat gant ar gartenn stankter EM izel-temperadur.
Kenurzhiañ α-His29 ha β-His36 a laka BChls da vezañ tal-ouzh-tal ; pep heterodimer αβ a vez bodet gant e amezeien evit sevel ur boukl digor (RC-LH114-W) pe ur boukl serr (RC-LH116) tro-dro d'ar RC. Keñveriet gant ar bann 877 nm eus RC-LH114-W, ar c'hemm ruz 880 nm eus RC-LH116 a zo 3 nm (Skeudenn 2A). Koulskoude eo tost an hevelep spektrum an dikroegezh kelc'hiek (Skeudenn 2B), ar pezh a ziskouez eo heñvel-tre endro lec'hel ar BChls, daoust ma'z eus un diforc'h sklaer etre ar boukloù digor ha serr. Ar c'hemm ruz a c'hell bezañ disoc'h ul lusk termek digresketoc'h hag ur stabilded kresket war ar boukl serr (18, 19), ar c'hemm e koublad ar pigmantoù degaset gant ar boukl serr (20, 21), pe ur meskaj eus an daou efed-se (11).
(A) Spektrum sunadur ultraviolet/gwelet/tost-infraruz, merket e begoù gant o livioù a glot ganto ha normalaet d'ar beg BPh da 775 nm. (B) Spektrum dikroizm kelc'hiek normalaet da absorbañs BChl da 805 nm. (C ha D) Spektrumoù ΔA dibabet diwar spektroù sugnañ diskoulmet dre amzer ar c'hemplezh RC-LH114-W (C) hag ar c'hemplezh RC-LH116 (D). Evit gwellaat ar c'heñveriañ e vez normalaet an holl spektroù da ∆A eus −A da 0,2 ps. (E) Feur oksiderezh ar c'hitokrom c2 goude ar skinadur e-tal kementadoù liesseurt a UQ2 (gwelet ar skeudenn S8 evit ar roadennoù c'hrouet). (F) E kelligoù kresket dindan gouloù izel, krenn pe uhel (10, 30 pe 300μMm-2 s-1, hervez an urzh), ar protein W hag an isunanennoù RC-L er c'hemplezh puraet hag ar feur membran dispartiet. Termeniñ al live protein dre elektroforezenn gel poliakrilamid SDS hag immunoassay (gwelet ar skeudenn S9 evit ar roadennoù c'hrouet). Termeniñ ar feur e-keñver ar c'hemplezh RC-LH114-W puraet. Ar feur stoikiometrikel etre RC-L ha protein-W ar c'hemplezh a zo 1:1.
Ar BChls e lec'h 1 e kelc'h αβ14 direizh RC-LH114-W (Skeudenn 1, A, C, hag E) a zo tostoc'h d'an donezon kentañ RC (P) gant 6,8Å eget ar BChls kevatal e RC-LH116 (Skeudenn 1, B, D, ha Skeudenn S3); koulskoude, ar c'hinetik absorbadur tremen eus an daou gemplezh a ziskouez eo evit RC-LH114-W ha RC-LH116, ar c'honstantoù amzer treuzkas energiezh eksitañ eus LH1 da RC a zo 40 ±4 ha 44±3 ps (Skeudenn 2). , C ha D, Skeudenn S4 ha Taolenn S2). N'eus diforc'h pouezus ebet ivez e-keñver an treuzkas elektronek e-barzh RC (Skeudenn S5 ha testenn ouzhpenn liammet). Soñjal a reomp eo abalamour d'ar pellder, d'ar c'horn ha d'an energiezh potentiel heñvel eus an darn vrasañ eus BChl en daou boukl LH1 eo ar c'heñveriañ tost etre an amzer treuzkas energiezh etre LH1 ha RC-P. War a seblant n'eo ket buanoc'h ergerzhout patrom energiezh LH1 evit tizhout ar pellder izelañ eget treuzkas energiezh reizh eus al lec'hioù is-optimal da RC. Ar boukl LH1 a boukl digor e RC-LH114-W a c'hell ivez tremen dre ul lusk termek dister e-barzh an amzerioù izel evit an dielfennadur frammadurel, hag ez eus ur c'hefluniadur gwalenn αβ14 hiroc'h e temperadur ar gambr diouzh pellder pigmantadur βBChls e lec'h RC 1.
Ar c'hemplezh RC-LH116 a endalc'h 32 BChls ha 16 karotenoid, hag e aozadur hollek a zo an hevelep hini hag an hini bet tapet diwar Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) DB (PDB) strain (PDB) (IDC 1979) ha bezhin glas (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Goude an aliañ, ne oa bet gwelet nemet diforc'hioù bihan e lec'hioù an heterodimeroù αβ, dreist-holl 1-5, 15 ha 16 (Skeudenn S6). Bezañs ar protein-W en deus un efed pouezus war framm LH1. Liammet eo e dri TMH dre boukloù berr, gant an N-termen war tu lumen ar c'hemplezh hag an C-termen war tu sitoplazmek (Skeudennoù 1A ha 3, A da D). Hidrofobek eo ar protein-W dre vras ​​(Skeudenn 3B), ha TMH2 ha TMH3 a genderc'h gant LH1αβ-14 evit sevel ur gorread treuzmembranek (Skeudenn 3, B hag E betek G). An etrefas a zo savet dreist-holl diwar restachoù Phe, Leu ha Val er rannvro treuzmembranek. Stanket eo ar restachoù-se gant asidoù amino hidrofobek ha pigmantoù αβ-14. Alc'hwezioù polar zo a gemer perzh ivez en etregwered, en o zouez al liamm hidrogen etre W-Thr68 ha β-Trp42 war gorre ar c'hoad kemplezh (Skeudenn 3, F ha G). War gorre ar sitoplazm emañ Gln34 e-kichen ar strollad keto karotenoidoù αβ-14. Ouzhpenn-se e oa bet diskoulmet ar volekulenn n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM), hag e lost hidrofob a oa astennet betek an etrefas etre ar protein-W hag αβ-14, hag e c'hallfe bezañ lec'hiet al lost lipid er c'horf. Merzet hon eus ivez e oa tost-tre ar rannvroioù diskoulm C-termenel eus ar protein W hag RCH, met n'int ket e-barzh tachenn stummañ etregweredoù resis (Skeudenn 1, A hag E). Koulskoude e c'hall bezañ etregweredoù e trenkennoù aminek C-termenel an div brotein-se, ar pezh a c'hall pourchas ur mekanik evit tuta ar protein-W e-pad bodañ ar c'hemplezh RC-LH114-W.
(A) Ar protein-W, a zo dirak an etrefas gant LH1αβ14 e stumm tresadennoù-bev, he deus ur chadenn gostez e stumm ur varrenn (ruz), diskouezet en ul lodenn eus an diagramm potentiel elektrostatek (gorread gris treuzwelus gant ul live kontur a 0,13). (B) Protein-W aroueziet gant ur gorread liv hidrofobek. Diskouezet e vez an tachennoù polarel ha karget e liv sian, an tachennoù hidrofobek e gwenn, hag an tachennoù hidrofobek kreñv en orañjez. (C ha D) Protein-W diskouezet en tresadennoù-bev, he stumm a zo heñvel ouzh hini (A) (C), ha troet e 180° (D). Hervez al lec'hiadur en heuliad e vez degemeret gant ar restachoù a c'haller diforc'hañ ur skeudenn livioù arc'hant, ma'z eo glas an N-termen hag ar C-termen ruz. (E) Protein-W er memes gwel hag e (A), hag ar restachoù e etrefas ar protein-W:LH1 a zo diskouezet gant barrennoù gant merkoù stag. (F) Protein-W a zo troet 90° e-keñver (E) ha LH1αβ14 er skeudennadur treset, ha e-keñver ar restachoù etrefas er skeudennadur barrennoù. Merket eo ar restachoù a-us d'ar polipeptid beta. Diskouezet eo ar c'hofaktor evel ur varrenn a glot gant liv ar skeudenn 1, ar β-DDM disrannet a zo diskouezet e gris, hag an oksigen a zo diskouezet e ruz. (G) Troet eo ar gwel e (F) 180°, gant dilerc'hioù pennañ ar polipeptid alfa merket.
Erlec'hiañ a ra ar protein-W un heterodimer αβ (ar 15vet e skeudenn 1F), dre-se e vez miret ouzh serriñ ar boukl ha ma vez stouet an tri heterodimer αβ kentañ. Gwelet e voe e oa 25° da 29° korn stouiñ uhelañ an heterodimer αβ-1 kentañ e-keñver ar film normal (Skeudenn 1, A hag E), a oa bet savet gant stouiñ 2° da 8° αβ-1 e RC A sharp contrast-LH116 (Skeudenn 1, B ha F). An eil hag an trede heterodimer a zo stouet eus 12° da 22° ha 5° da 10°, hervez an urzh. Abalamour da harz sterek RC, n'eo ket enklozet an eil koublad αβ (a glot gant ar 16vet αβ e skeudenn 1F) e stouadur αβ-1, o sevel evel-se un toull sklaer e-barzh ar walenn LH1 (skeudenn 1, A hag E) . Abalamour da vank daou heterodimer αβ, asambles gant koll pevar BChl ha daou garotenoid, ne stag hini ebet eus ar c'harotenoidoù ouzh an isunanenn αβ-1 troet, ar pezh a zegas ur walenn LH114-W ennañ 13 karotenoid Vegetarian ha 28 BChls. Izeloc'h eo prizioù resolution lec'hel an daou gemplezh er rannvroioù αβ1 da 7 eget re ar peurrest eus ar boukl LH1, ar pezh a c'hellfe diskouez plastikelezh diazez an isunanenn LH1 e-kichen al lec'hienn RC QB (Skeudenn 4) .
Skeudennoù RC-LH114-W (A ha B) ha RC-LH116 (C ha D) a zo diskouezet diwar ar memes gwel uhelañ/gwel a-gostez (A ha B) (A ha C) ha gorread ar c'hoad e Fig. 1. (B ha D). Diskouezet e vez an alc'hwezioù livet a-zehou.
Ar c'hemplezh diazez nemetañ all gant ur feur stoikiometrikel a 1:14 eo an dimer Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Koulskoude, protein W ha PufX n'o deus ket un heñvelster anat, hag o deus un efed pouezus war o frammoù LH1. PufX zo un TMH hepken gant un domani sitoplazmek N-termenel hag a etregwered gant tu sitoplazmek an isunanenn RC-H (13) en ul lec'h a glot gant Rps. palustris LH116αβ-16. Krouiñ a ra PufX ur chadenn evit an eskemm kinon/kinolon etre RC-LH1 hag ar c'hemplezh sitokrom bcl hag a gaver en holl Rba. kemplezh kreiz sphaeroides (13). Daoust ma'z eo an etrefas monomer-monomer e Rba. Lec'hiet eo an dimer sphaeroides RC-LH1-PufX e lec'h stagañ ar protein W e RC-LH114-W, hag an diforc'h degaset gant PufX hag ar protein-W a zo en ul lec'h kevatal (Skeudenn S7A). Ar c'heflusker e RC-LH114-W a zo ivez liammet ouzh ar c'hanol kinon hipotetek (8) eus Pseudomonas rosea LH1, a zo savet gant peptidoù n'int ket liammet ouzh ar protein W pe PufX (Skeudenn S7B). Ouzhpenn-se, ar ganol kinon e Blc. An LH1 glas-smerald savet dre lemel un isunanenn γ (7) a zo lec'hiet en ur lec'h heñvel (Skeudenn S7C). Daoust ma vezont treuzkaset gant proteinoù disheñvel, e seblant bezañ ur skouer eus an emdroadur kenstag, ar pezh a ziskouez e c'hall ar c'heflusker krouet gant ar protein W ober evel ur ganol kinon.
Ar c'heflusker e-barzh ar boukl LH114-W a aotre da grouiñ ur rannvro grogenn kendalc'hus etre an egor diabarzh eus ar c'hemplezh RC-LH114-W hag ar grogenn vras ​​(Skeudenn 1G), e-lec'h liammañ an daou domani dre ur porzh protein evel er proteinoù. Heñvel eo ar c'hemplezh RC-LH116 ouzh un Tch serr. Kemplezh heñvel ouzh an nadoz (22) (Skeudenn 1H). Dre ma vez buanoc'h skignañ ar c'hinon dre ar grogenn eget skignañ dre ar ganol protein strizh, e c'hall ar boukl LH114-W digor aotren un troc'h RC buanoc'h eget ar boukl LH116 serr, ha skignañ ar c'hinon er RC a c'hall bezañ strishoc'h. Evit gwiriañ hag-eñ e vez levezonet treuzfurmadur ar c'hinonoù dre RC gant ar protein W, hon eus graet un amprouenn oksidadur sitokrom war ur c'hementad resis a ubikinon 2 (UQ2) (un analog eus UQ10 naturel gant ul lost izopren berroc'h) (Skeudenn 2E). Daoust ma vez harzet gant bezañs ar c'hinon kelatet termeniñ reizh ar c'honstant Michaelis war a seblant (RC-LH114-W ha RC-LH116 a zo dereat evit 0,2±0,1μM ha 0,5±0,2μM, hervez an urzh), eo ar feur uhelañ a RC-LH114-W ( 4,6±0,6±0,2μM) s-1-1-2. 28±5% brasoc'h eget RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Da gentañ hon eus priziet e oa ar protein-W e-barzh war-dro 10% eus ar c'hemplezh diazez (16); amañ eo 15±0,6%, 11±1% ha 0,9±0,5, hervez o urzh, feur aloubadeg ar c'helligoù kresk izel, krenn ha uhel (Skeudenn 2F). Keñveriañ kementadel ar spektrometriezh tolz a ziskouezas ne zigreske ket ouzhpennañ an tikedenn histidin an niver keñverel a brotein-W e-keñver ar spesadoù gouez (P = 0,59), setu n'eo ket al liveoù-se un artefakt eus ar protein-W kemmet (Skeudenn S10). Koulskoude, an dalc'h izel-se a brotein-W er c'hemplezh RC-LH1 a c'hellfe reiñ tu da RCoù zo da dreiñ buanoc'h, o ledanaat an eskemm kinon/kinolon gorrekoc'h er c'hemplezh RC-LH116. Merzet hon eus ne glot ket ar feur dalc'husted uhel gant ar roadennoù treuzskrivomek diwezhañ, ar pezh a ziskouez e kresk an eztaol gen pufW dindan ar gouloù kreñv (Skeudenn S11) (23). An diforc'h etre treuzskrivadur pufW hag enkorfadur protein-W er c'hemplezh RC-LH1 a zo kemplezh ha gallout a ra diskouez reoliñ kemplezh ar protein.
E RC-LH114-W e vez rannet 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) ha 29 volekulenn β-DDM ha modelet ennañ 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG ha 21βD. RC-LH116 (Skeudenn 5, A ha B). En div framm-se emañ CDL lec'hiet tost war tu sitoplazmek ar c'hemplezh, tra ma vez lec'hiet POPC, POPG ha β-DDM dreist-holl war tu luminel. Daou volekulenn lipid ha diwaller a oa bet dizoloet e rannvro αβ-1 da αβ-6 ar c'hemplezh RC-LH114-W (Skeudenn 5A), ha pemp a oa bet dizoloet e rannvro kevatal da RC-LH116 (Skeudenn 5B ). Kavet e voe muioc'h a lipidoù en tu all d'ar c'hemplezh, dreist-holl CDL, dastumet etre RC hag αβ-7 betek αβ-13 (Skeudenn 5, A ha B). Lec'hiet e vez lipidoù ha produioù all diskoulmet dre framm e-maez ar walenn LH1, ha chadennadoù asil diskoulmet mat a astenn etre isunanennoù LH1, anvet da gentañ evel β-DDM e RC-LH114-W, ha termenet evel β-DDM e RC A meskaj β-DDM ha PO-LH16-LH16. Lec'hiadurioù heñvel al lipidoù kelatañ hag an diwaller en hor framm a ziskouez ez int lec'hioù liammañ a-bouez war an dachenn fiziologel (Skeudenn S12A). Lec'hiadurioù ar molekulennoù kevatal e Tch o deus ivez ur c'heñveriañ mat. Dous ha Trv. Ar spesad 970 RC-LH1s (Skeudenn S12, B da E) (9, 12) hag ar restachoù liammet gant hidrogen eus ar strollad penn lipidek o deus diskouezet ur gwarez mat a-walc'h en aliañ an heuliadoù (Skeudenn S13), ar pezh a ziskouez e c'hall al lec'hiennoù-se bezañ miret er c'hemplezh RCH-LH1.
(A ha B) Ar peptidoù RC-LH114-W (A) ha RC-LH116 (B) a zo diskouezet gant tresadennoù-bev, hag ar pigmantoù a zo diskouezet gant barrennoù, en ur implijout ar skeudenn livioù e skeudenn 1. Diskouezet eo al lipidoù e ruz, hag an diwalleroù e gris. Melen eo an UQ stag ouzh al lec'hiennoù RC QA ha QB, tra ma'z eo glas an UQ digenvez. (C ha D) Ar memes selloù hag (A) ha (B), gant lipidoù dilezet. (E da G) Gwel brasaet eus Q1(E), Q2(F) ha Q3(G) eus RC-LH116, gant chadennoù kostez a levezon an eil re all. Diskouezet eo al liammoù hidrogen evel linennoù strizh du.
E RC-LH116 e vez disrannet RC QA ha QB UQ, a gemer perzh en treuzkas elektronoù en argerzh dispartiañ ar c'hargoù, en o lec'hioù liammañ. Koulskoude, e RC-LH114-W, n'eo ket bet diskoulmet ar c'hinon QB ha komzet e vo diwar e benn amañ dindan. Ouzhpenn ar c'hinonoù QA ha QB e vez rannet daou volekulenn UQ kelatet (lec'hiet etre ar c'helc'hioù RC ha LH1) er framm RC-LH114-W hervez o strolladoù penn diskoulmet mat (lec'hiet e Q1 ha Q2, hervez o urzh). egor). Skeudenn 5C). Daou unanenn izopren a zo lakaet da Q1, hag ar gartenn stankter a ziskoulm an 10 lost izopren klok eus Q2. E framm RC-LH116 e oa bet diskoulmet teir volekulenn UQ10 kelatet (Q1 da Q3, skeudenn 5D), hag an holl volekulenn o deus ur stankter sklaer a-hed al lost (Skeudenn 5, D da G). En div framm, lec'hiadurioù ar strolladoù penn kinon Q1 ha Q2 o deus ur c'heñveriañ dreistordinal (Skeudenn S12F), ha n'int nemet etregwelet gant RC. Q1 a zo lec'hiet e mont e-barzh ar c'heflusker W eus RC-LH114-W (Skeudenn 1G ha 5, C, D hag E), ha Q2 a zo lec'hiet e-kichen al lec'h liammañ QB (Skeudenn 5, C, D) ha F). Tost-tre eo ar restachoù L-Trp143 ha L-Trp269 miret ouzh Q1 ha Q2 hag a ginnig etregweredoù π-stacking a c'hallfe bezañ (Skeudenn 5, E ha F, ha Skeudenn S12). L-Gln88, 3,0 Å diouzh oksigen distal Q1, a ginnig ul liamm hidrogen kreñv (Skeudenn 5E); miret eo ar restad-se en holl RCoù nemet en darempred pellañ (Skeudenn S13). Erlec'hiet eo L-Ser91 gant Thr en un doare mirour en darn vrasañ eus an RCoù all (Skeudenn S13), 3,8 Angstrom eo diouzh oksigen metil Q1, ha gallout a ra pourchas liammoù hidrogen gwan (Skeudenn 5E). Q3 ne seblant ket kaout un etregwered resis, met lec'hiet eo er rannvro hidrofobek etre an isunanenn RC-M hag an isunanenn LH1-α 5 da 6 (Skeudenn 5, D ha G). Q1, Q2 ha Q3 pe ar c'hinonoù kelat tost a zo bet diskoulmet ivez e Tch. Dous, Trv. Soc'h 970 ha Blc. Ar framm iris (9, 10, 12) a ziskouez ul lec'h stagañ kinon skoazell miret er c'hemplezh RC-LH1 (Skeudenn S12G). Ar pemp UQ disrannet e RC-LH116 a glot mat gant ar 5,8±0,7 eus pep kemplezh termenet dre ar c'hromatografiezh dourennek uhel (HPLC), tra ma'z eo izeloc'h an tri UQ disrannet e RC-LH114-W eget Ar werzh muzuliet a 6,2±0,3 (Skeudenn S14) a ziskouez n'eus ket a diskoulmoù e-barzh ar molekulennoù UQ. framm.
Ar polipeptidoù L ha M pseudo-simetriek a endalc'h pep hini pemp TMH hag a ya d'ober un heterodimer a zastum un dimer BChl, daou monomer BChl, daou monomer bakteriofag (BPh), hag un houarn hep Heme hag unan pe ziv volekulenn UQ10. Dre bezañs liammoù hidrogen war ar strollad keton termenel hag e zastum anavezet e Rps e vez enkorfet ar c'harotenoidoù en isunanenn M, anvet cis-3,4-dehydroorhodopin. Spesadoù (25). Staget eo domani ar grogenn diavaez eus RC-H ouzh ar grogenn gant un TMH hepken. Heñvel eo framm hollek an RC ouzh an tri isunanenn RC eus ar spesadoù kar (evel Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Makrokelc'hiadoù BChl ha BPh, ar c'harotenoid hag an houarn nann-hem a glot e-barzh tachenn disoc'h ar frammoù-se, evel ma ra ar strollad penn UQ10 el lec'h QA hag ar c'hinon QB e RC-LH116 (Skeudenn S15).
An doare da gaout daou framm RC gant feur aloubadeg lec'hiennoù QB disheñvel a ginnig un digarez nevez da zizoleiñ ar c'hemmoù stumm kempoell a ya gant liammañ ar c'hinon QB. Er c'hemplezh RC-LH116 emañ ar c'hinon QB e lec'h “tost” stag penn-da-benn (26), met n'eus ket ar c'hinon QB e disparti RC-LH114-W. N'eus kinon QB ebet e RC-LH114-W, ar pezh a zo souezhus rak oberiant eo ar c'hemplezh, muioc'h eget ar c'hemplezh RC-LH116 gant kinon QB diskoulmet dre framm. Daoust ma vez kelatet war-dro c'hwec'h kinon gant an daou walenn LH1, pemp a zo diskoulmet dre framm er walenn RC-LH116 serr, tra ma ne vez bevennet nemet tri anezho er walenn RC-LH114-W digor. An direizhder frammadurel kresket-se a c'hellfe diskouez an erlec'hiañ buanoc'h eus al lec'hiennoù QB RC-LH114-W, ar c'hinetik kinon buanoc'h er c'hemplezh, hag ar c'hresk a varregezh da dreuziñ ar boukl LH1. Kinnig a reomp e c'hallfe an diouer a UQ e lec'hienn RC QB RC-LH114-W bezañ disoc'h ur c'hemplezh kempleshoc'h hag oberiant, ha lec'hienn QB RC-LH114-W a zo bet skornet diouzhtu e troc'h UQ Ar prantad resis (serret eo bet mont e-barzh al lec'hienn QB) a ziskouez stummadur an obererezh-se.
Hep QB, troiadur L-Phe217 a-gevret betek ul lec'h na glot ket gant liammañ UQ10, rak lakaat a raio ur stokadenn egorel gant unanenn izopren kentañ al lost (Skeudenn 6A). Ouzhpenn-se eo anat ar c'hemmoù stumm pennañ anat, dreist-holl an heliks de (heliks berr er boukl etre TMH D hag E) ma vez dilec'hiet L-Phe217 d'ar godell liammañ QB ha troiadur L-Tyr223 (Skeudenn 6A ) Evit terriñ al liamm hidrogen gant ar framm M-Ap4 ha serriñ a ra ar framm liammañ QB lec'hienn (Skeudenn 6B). Troc'hañ a ra an heliks en he diazez, Cα L-Ser209 a zo dilec'hiet eus 0,33Å, tra ma vez dilec'hiet L-Val221Cα eus 3,52Å. N'eus kemm ebet a c'haller gwelet e TMH D hag E, a c'haller lakaat war-eeun en daou framm (Skeudenn 6A). Evit ar pezh a ouzomp, setu ar framm kentañ er RC naturel a serr al lec'hienn QB. Ur c'heñveriañ gant ar framm klok (stag ouzh QB) a ziskouez e ranker cheñch stumm evit lakaat anezhañ da vont e-barzh ar c'hinon a-raok ma vo digresket ar c'hinon. Troiñ a ra L-Phe217 evit sevel un etregwered π-stacking gant ar strollad penn kinon, hag an heliks a zilec'h war-du an diavaez, ar pezh a ro tro da askorn L-Gly222 ha da chadenn kostez L-Tyr223 da sevel ur rouedad liammoù hidrogen gant ur framm liammoù hidrogen stabil (Skeudenn 6, A ha C).
(A) Tresadennoù-bev dreist-holl eus an hologramm (chadenn L, chadenn orañjez/M, magenta) hag eus ar framm apo (gris), ma vez diskouezet ar restachoù pennañ e stumm ur skeudennadur a-feson. UQ10 a zo diskouezet gant ur varrenn velen. Al linenn strizh a ziskouez al liammoù hidrogen savet er framm a-bezh. (B ha C) Diskouezadur gorre an apolipoprotein hag ar framm a-bezh, o lakaat war wel oksigen chadenn kostez L-Phe217 e glas ha L-Tyr223 e ruz, hervez an urzh. Orañjez eo an isunanenn L ; n'eo ket livet an isunanennoù M hag H. (D hag E) Apolipoprotein (D) hag a-bezh (E) lec'hiennoù RC QB [liv gant (A) hervez] ha Thermophilus thermophilus PSII (glas, glas gant kinon plastik; PDB ID: 3WU2) Align (58).
Dic'hortoz, daoust ma vez kavet meur a framm RCoù hep LH1 hep QB, n'eo ket bet danevellet a-raok ar c'hemmoù stumm bet gwelet er studiadenn-mañ. En o zouez emañ ar framm diskar QB eus Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ha Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), an holl anezho tost heñvel ouzh o framm QB hollek. Ur skoueriekaat a-dost eus 3PRC a ziskouezas e vez staget molekulennoù diwaskañ LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ouzh mont e-barzh ar savlec'h QB, ar pezh a c'hallfe mirout ouzh an adkempenn en ur stumm serr. Daoust ma ne zistruj ket LDAO er memes lec'h e 1EYS pe 1OGV e vez prientet an RC-se gant ar memes diwaller ha dre-se e c'hellont produiñ ar memes efed. Struktur kristal Rba. Sphaeroides RC kenkristalizet gant sitokrom c2 (PDB ID: 1L9B) a seblant kaout ul lec'h QB serr ivez. Koulskoude, er c'has-mañ, e kemer rannvro N-termen ar polipeptid RC-M (o kejañ gant al lec'h liammañ QB dre liamm H ar restad Tyr war an heliks Q) ur c'honformadur dic'hortoz, ha n'eo ket bet studiet pelloc'h ar c'hemm stumm QB (30 ). Ar pezh a zo sur eo n'hon eus ket gwelet ar seurt distummadur-se eus ar polipeptid M er framm RC-LH114-W, a zo tost an hevelep hini hag ar rannvro N-termenel eus RC-LH116 RC. Ret eo ivez merkañ e oa bet diskoulmet an RCoù apolipoprotein er PDB goude bezañ bet distrujet an antenn LH1 diazezet war ar gwalc'hiñ, ar pezh en doa diverket ar poulloù kinon diabarzh hag al lipidoù er c'heflusker etre an RC ha gorread diabarzh ar walenn LH1 tro-dro (31, 32). Chom a ra RC fonksionel rak mirout a ra an holl c'hofaktoroù, nemet ar c'hinon QB distrujus, a zo nebeutoc'h stabil hag a vez kollet alies e-pad ar c'houlzad prientiñ (33). Ouzhpenn-se e ouzer e c'hall tennañ LH1 ha lipidoù kelc'hiek naturel eus RC kaout un efed war ar fonksionoù, evel padelezh berroc'h ar stad P+QB dispartiet gant ar garg (31, 34, 35). Dre-se e soñjomp e c'hallfe bezañs ar c'helc'h LH1 lec'hel tro-dro d'ar RC mirout al lec'hienn QB “serret”, o virout an endro lec'hel e-kichen ar QB.
Daoust ma ne zastum an apolipoprotein (hep kinon QB) hag ar framm klok nemet daou skeudenn eus troc'h al lec'hienn QB, kentoc'h eget un heuliad darvoudoù, ez eus diskouezadegoù e c'hall al liammañ bezañ stanket evit mirout ouzh an adstagañ gant an hidrokinon. Evit mirout ouzh an harz d'ar substrad. Disheñvel e c'hall bezañ etregweredoù ar c'hinolol hag ar c'hinon e-kichen lec'h QB an apolipoprotein, ar pezh a gas d'e nac'hadenn gant RC. Kinnig a reer abaoe pell e c'hoari ar c'hemmoù stumm ur roll e liammañ ha digreskiñ ar c'hinonoù. Gwallgaset eo galloud an RCoù skornet da zigreskiñ ar c'hinonoù goude an emdroadur teñval (36); Diskouez a ra ar c'hristalografiezh dre skinoù X eo deuet an distruj-se abalamour d'ar c'hinonoù QB a zo dalc'het en ur c'honformadur “distal” war-dro 4,5 Å diouzh al lec'h proksimal oberiant (26) , 37). Kinnig a reomp eo ar c'honformadur liammañ distal-mañ ur skeudenn eus ar stad etre etre an apolipoprotein hag ar framm walenn leun, a heuilh an etregwered kentañ gant ar c'hinon hag an digoradur eus al lec'hienn QB.
Ar RC doare II a gaver e kemplezh PSII bakterioù fototrofek ha sianobakteriennoù, algaeoù ha plant zo en deus ur gwarez frammadurel ha fonksionel (38). An aliañ frammadurel diskouezet e skeudenn 6 (D hag E) a laka war wel ar heñvelder etre RCoù PSII ha lec'h QB ar c'hemplezh RC bakteriel. Ar c'heñveriañ-se a zo bet abaoe pell ur patrom evit studiañ ar reizhiadoù liammet ha digreskiñ ar c'hinon tost-tre. Embannadurioù kent a ziskoueze e veze heuliet ar c'hemmoù stumm gant un digresk PSII eus ar c'hinonoù (39, 40). Dre-se, pa seller ouzh mirout emdroadur an RC, e c'hallfe ar mekanik liammañ-se na oa ket bet gwelet a-raok bezañ arveret ivez evit lec'hienn QB PSII RC e plant fototrofek oksigenet.
Rps ΔpufW (dilemel pufW hep tikedenn) ha PufW-His (protein-W merket gant His 10x C-terminal eztaolet diwar al lec'h pufW naturel). palustris CGA009 a oa bet deskrivet en hor labour kent (16). Adtapout a reer ar spesadoù-se hag ar par isogenek eus ar seurt gouez eus ar skorner dre strishaat un niver bihan a gelligoù war PYE (pep hini 5 g litrad -1) (miret e LB da -80 °C, ennañ 50% ( p/v) gliserol) protein, tennañ goell ha suksinat) agar [1,5%/v) pladenn. Goret e voe ar bladenn e-pad an noz en deñvalijenn e temperadur ar gambr dindan an amzer anaerobek, ha goude-se e voe sklêrijennet gant gouloù gwenn (~50 μmolm-2 s-1) pourvezet gant boulc'hoù halogen OSRAM 116-W (RS Components, UK) e-pad 3 pe 5 devezh betek ma teufe war wel ur c'holoniezh hepken. Ur c'holoniezh hepken a voe implijet evit enlakaat 10 ml a metoù M22+ (41) ouzhpennet gant 0,1% (p/v) a asidoù kasamino (anvet M22 amañ da c'houde). Kreskiñ a reas ar sevenadur dindan an oksigen izel en deñvalijenn da 34°C gant hejañ da 180 troatad dre vunutenn e-pad 48 eurvezh, ha goude-se e voe enlakaet 70 ml eus ar sevenadur dindan an hevelep stadoù e-pad 24 eurvezh. Implijet e vez ur sevenadur hanter-aerobek gant ur volum a 1 ml evit enlakaat 30 ml a endro M22 en ur voutailh gwer treuzwelus hollvedel 30 ml gant ur skramm ha skignet gant un nerzh magnetek steril Stirring rod. Neuze e voe enlakaet 30 ml eus ar sevenadur gant war-dro 1 litrad sevenadur dindan ar memes doareoù, a voe implijet neuze evit enlakaat war-dro 9 litrad sevenadur sklêrijennet da ~200 μmolm-2 s-1 e-pad 72 eurvezh. Dastumet e voe ar c'helligoù dre greizennañ da 7132 RCF e-pad 30 munutenn, adlakaet e ~10 ml a 20 mM tris-HCl (pH 8,0), ha miret da -20°C betek ma voe ezhomm.
Goude bezañ dizoloet, ouzhpennit un nebeud kristalennoù dezoksiribonukleaz I (Merck, Rouantelezh-Unanet), lisozim (Merck, Rouantelezh-Unanet) ha daou bladenn Roche holoenzyme inhibitor protease (Merck, Rouantelezh-Unanet) d'ar c'helligoù adstaget. En ur gellig gwask gall 20 000 psi (Aminco, SUA) e oa bet torret ar c'helligoù 8 da 12 gwech. Goude bezañ tennet ar c'helligoù didorr hag an dilerc'hioù dizoloet dre greizennañ da 18 500 RCF e-pad 15 munutenn da 4°C, e voe diskaret ar grogenn diwar al lizad pigmentet dre greizennañ da 113 000 RCF e-pad 2 eurvezh da 43 000 °C. Lakaat ar fraksion dizoloet da vont kuit ha lakaat ar grogenn livet en-dro e 100 da 200 ml a 20 mM tris-HCl (pH 8,0) ha homogeniñ betek ma ne vo ket agregadoù gwelus. Ar grogenn distag a oa bet goret e 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, SUA) ennañ 2% (p/v) β-DDM e-pad 1 eurvezh en deñvalijenn da 4°C gant ur meskaj dous. Goude-se e vez greizennet da 70°C evit dizoloiñ 150 000 RCF da 4°C e-pad 1 eurvezh evit lemel an dizoloadennoù a chom.
Lakaet e voe ar grogenn solubilizañ eus ar spesad ΔpufW war ur bann 50 ml DEAE Sepharose exchange ion gant tri volum kolonenn (CV) a tampon liammañ [20 mM tris-HCl (pH 8,0) ennañ 0,03% (p / v) β-DDM]. Gwalc'hit ar golonenn gant daou tampon liammañ CV, ha goude-se gwalc'hit ar golonenn gant daou tampon stagañ enno 50 mM NaCl. Eluet e voe ar c'hemplezh RC-LH116 gant ur gradient linennek eus 150 da 300 mM NaCl (e tampon liammañ) war 1,75 CV, hag ar c'hemplezh liammañ a chom a voe eluet gant ur tampon liammañ ennañ 300 mM NaCl war 0,5 CV. Dastum ar spektrum sunañ etre 250 ha 1000 nm, mirout ar fraksion gant ur feur sunañ (A880/A280) brasoc'h eget 1 e 880 da 280 nm, diluziañ anezhañ div wech er buffer liammañ, hag implijout ar memes argerzh en-dro war ar bann DEAE War ar glanaat. Diluiñ ar fraksionoù gant feurioù A880/A280 uheloc'h eget 1,7 ha feurioù A880/A805 uheloc'h eget 3,0, ober an trede tro eskemm ionoù, ha mirout ar fraksionoù gant feurioù A880/A280 uheloc'h eget 2,2 ha feurioù A880/A805 uheloc'h eget 5,05. Ar c'hemplezh puraet evit ul lodenn a voe kenstrollet betek ~2 ml en ur sil kreizdredan Amicon 100,000 (MWCO) (Merck, Rouantelezh-Unanet), ha karget war ur bann Superdex 200 ment 16/600 (GE Healthcare, SUA) enni 200 mM NaCl, ha goude-se e voe skarzhet er memes tampenn 15.000. CV. Dastum spektroù sunidigezh ar fraksion diverkañ ment, ha strollañ ar spektroù sunañ gant keñverioù A880/A280 ouzhpenn 2,4 ha keñverioù A880/A805 ouzhpenn 5,8 da 100 A880, hag implijout anezho diouzhtu evit prientiñ pe stokañ ar rouedad krio-TEM Mirout da -80°C betek ma vo ezhomm.
Lakaet e voe ar grogenn solubilizañ eus ar spesad PufW-His war ur golonenn HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8,0) ennañ 200 mM NaCl ha 0,03% (p/p)) e-barzh ur buffer IMAC ( GE Healthcare). v) β-DDM]. Gwalc'het e voe ar golonenn gant pemp CV tampon IMAC, ha goude gant pemp CV tampon IMAC ennañ 10 mM histidin. Eluet e voe ar c'hemplezh diazez eus ar golonenn gant pemp tampon IMAC enno 100 mM histidin. Ar fraksion a endalc'h ar c'hemplezh RC-LH114-W a vez strollet betek ~10 ml en ur pod mesket gant ur sil Amicon 100,000 MWCO (Merck, Rouantelezh-Unanet), diluet 20 gwech gant un tampenn stagañ, ha goude-se ouzhpennet da 25 ml E kolonenn DEAE Sepharose e vez implijet pevar tamponenn CV liammet ouzh ar tampon b en a-raok. Gwalc'hit ar golonenn gant pevar tampon liammañ CV, ha goude-se eluit ar c'hemplezh war eizh CV war ur gradient linennek eus 0 da 100 mM NaCl (e tampon liammañ), hag ar pevar CV all a endalc'h tampon liammañ 100 mM. Ar feur A880/A805 uheloc'h eget 4,6 a oa bet strollet betek ~2 ml en ur sil kreizdredan Amicon 100,000 MWCO, ha leuniet gant 1,5 CV IMAC en a-raok. Dastum spektroù sugnañ ar fraksionoù ment-distaol ha kenderc'hel ar spektroù sugnañ gant keñverioù A880/A280 ouzhpenn 2,1 ha keñverioù A880/A805 ouzhpenn 4,6 da 100 A880, a vez implijet diouzhtu evit prientiñ ar rouedad TEM skornet pe miret da -80°C betek an ezhomm.
Ur c'heflusker Leica EM GP a oa bet implijet evit prientiñ rouedadoù TEM izel. Diluet e voe ar c'hemplezh e tampenn IMAC betek A880 a 50, ha goude-se e voe karget 5μl war ur roued kouevr goloet gant karbon QUANTIFOIL 1.2/1.3 nevez-diskarget (Agar Scientific, Rouantelezh-Unanet). Gorviñ ar rouedad da 20°C ha 60% a glebor keñverel e-pad 30 s, goude-se sec'hañ anezhañ e-pad 3 s, ha goude-se lazhañ anezhañ en etan liñvel da -176°C.
Roadennoù ar c'hemplezh RC-LH114-W a oa bet enrollet war an eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) gant ur mikroskop Titan Krios, a labour gant ur voltadur buanaat a 300kV, gant ur brasadur anv a 130 000× hag un energiezh a 200kV. Ur Gatan 968 GIF Quantum gant detekter pik K2 a oa bet implijet evit enrollañ skeudennoù e mod kontañ evit dastum roadennoù. 1,048Å eo ment ar piksel kalibret, ha 3,83 e-Å-2s-1 eo ar feur doare. Dastumet ar film e-korf 11 eilenn ha rannet e 40 lodenn. Implijit an dachenn goloet gant karbon evit adkas ar mikroskop, ha goude-se dastumit teir film dre toull. En holl e oa bet dastumet 3130 film, gant talvoudoù difokus etre -1 ha -3μm.
Dastumet e oa bet ar roadennoù evit ar c'hemplezh RC-LH116 gant ar memes mikroskop e Labourva Biostruktur Asterbury (Skol-veur Leeds, Rouantelezh-Unanet). Dastumet e oa bet ar roadennoù e mod kontañ gant ur brasadur a 130 k, ha kalibret e oa bet ment ar piksel da 1,065 Å gant un doare 4,6 e-Å-2s-1. Enrollet e oa bet ar film e 12 eilenn ha rannet e 48 lodenn. En holl e oa bet dastumet 3359 film, gant talvoudoù difokus etre -1 ha -3μm.
An holl dreuzfurmadurioù roadennoù a vez graet e-barzh ar stlennvon Relion 3.0 (42). Implijit Motioncorr 2 (43) evit reizhañ fiñv ar skin dre bouezañ an doareoù, ha goude-se implijit CTFFIND 4.1 (44) evit termeniñ ar perzh CTF (arc'hwel treuzkas keñver). Diskouezet eo ar fotomikrografoù boas goude ar prantadoù tretañ kentañ-se e skeudenn 2. S16. Krouet e vez ar patrom dibab emgefre dre zibab dre zorn war-dro 250 piksel eus 1000 rannig en ur framm 250 piksel ha hep rummatadur divdimensionel (2D) dave, ha dre-se e vez nac'het ar rummatadurioù a glot gant saotradur ar skouerenn pe n'o deus perzhioù dibar ebet. Neuze e voe graet un dibab emgefre war an holl mikroluc'hskeudennoù, hag an RC-LH114-W a oa 849 359 rannig, hag ar c'hemplezh RC-LH116 a oa 476 547 rannig. An holl rannigoù dibabet o deus tremenet daou dro rummatadur 2D hep dave, ha goude pep redadeg e vez nac'het ar rannigoù a glot gant gorread karbon, saotradur ar skouerenn, perzhioù anat ebet pe rannigoù a glot kreñv, ar pezh a laka 772 033 (90,9%) ha 359 678 (75,55 ) rannigoù da vezañ implijet evit ar renkadur 3D 3D. RC-LH114-W ha RC-LH116 hervez an urzh. Ar patrom dave 3D kentañ a oa bet krouet dre implijout an doare diskenn gradient stokastik. Gant ar patrom kentañ evel dave e vez renket ar rannigoù dibabet e pevar rummad e 3D. Gant ar patrom er rummad-mañ evel daveenn, grit ur rafinadur 3D war ar rannigoù er rummad brasañ, goude-se implijit ar sil tremen izel kentañ 15Å evit goleiñ an dachenn dizoloer, ouzhpennit 6 piksel a riblennoù dous, ha goude-treuzfurmiñ ar pikseloù evit reizhañ arc'hwel treuzkas moduladur pik Gatan K2 an detekter uhelañ. Evit ar roadennoù RC-LH114-W e oa bet kemmet ar patrom kentañ-mañ dre lemel ar stankter kreñv e ribloù ar maskl (distaget diouzh stankter ar c'hemplezh diazez e UCSF Chimera). Ar patromoù a zeu diwarno (disoc'hoù RC-LH114-W ha RC-LH116 a zo 3,91 ha 4,16 Å, hervez an urzh) a vez implijet evel dave evit an eil tro rummatadur 3D. Ar rannigoù implijet a zo strollet er c'hlas 3D kentañ ha n'o deus ket ur c'heñveriadur kreñv gant ar c'harter. Treuzkas pe mank a elfennoù frammadurel anat. Goude an eil tro rummatadur 3D e oa bet dibabet ar rummad gant ar resolution uhelañ [Evit RC-LH114-W, ur rummad a zo 377 703 rannig (44,5%), evit RC-LH116, ez eus daou rummad, en holl 260 752 rannig (54,7% W), pa vezont lakaet war-lerc'h an hevelep hini hepken, pa vezont lakaet war-lerc'h an hevelep hini hepken. troiadur kentañ gant un diforc'h bihan]. Adtennet e vez ar rannigoù dibabet en ur voest 400 piksel ha reizhet dre reizhadur 3D. Krouet eo ar maskl dizoloer dre implijout ar sil tremen izel 15Å kentañ, un astenn kartenn 3 piksel hag ur maskl dous 3 piksel. Gant ar c'hefluniadur CTF dre rannig, ar reizhadur lusk dre rannig hag an eil tro kefluniadur CTF dre rannig, e vez graet ar c'hefluniadur 3D, ar masklañ gant an dizoloer hag ar post-treuzfurmiñ goude pep pazenn evit kefluniañ muioc'h c'hoazh an teñzor a zeu diwarnañ. Gant ar werzh troc'h FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) a 0,143, eo 2,65 ha 2,80Å disoc'hoù ar patromoù diwezhañ RC-LH114-W ha RC-LH116, hervez an urzh. Diskouezet eo kromm FSC ar patrom diwezhañ e skeudenn 2. S17.
An holl heuliadoù protein a vez pellgarget diwar UniProtKB : LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) a oa bet implijet evit sevel ur patrom homologiezh eus RC, ennañ heuliadoù proteinoù RC-L, RC-M ha RC-H ha framm kristal Rba. sphaeroides RC a oa bet implijet evel patrom (PDB ID: 5LSE) (46). Implijit an ostilh "kartenn-embann" e UCSF Chimera evit lakaat ar patrom krouet da glotañ gant ar gartenn (47), gwellaat framm ar protein, ha kofaktor [4×BChl a (anv ar restachoù levraoueg monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), unan pe daou seurt UQ10 (U10), un houarn nann-hem (Fe) hag un heksadikarilin,34 (QAK)] implijit Coot (48) evit ouzhpennañ. Dre ma n'eo ket bet kavet QAK el levraoueg monomeroù eo bet parametraet dre implijout an ostilh eLBOW e PHENIX (49).
Da c'houde e voe savet an isunanenn LH1. Da gentañ e oa bet implijet an ostilh sevel emgefre e PHENIX (49) evit sevel emgefre ul lodenn eus an heuliad LH1 en ur implijout ar gartenn hag an heuliadoù protein LH1-α ha LH1-β evel mont e-barzh. Dibabit an isunanenn LH1 klokañ, tennit anezhi ha kargit anezhi e Coot, ouzhpennit dre zorn an heuliad mankout ennañ, ha reizhañ dre zorn ar framm a-bezh a-raok ouzhpennañ daou BCl a (BCL) hag ur spirilloxanthin (CRT) [hervez an Rps a-bouez Stankter ar c'hemplezh LH1 hag an endalc'had karotenoid anavezet. Spesadoù (17)]. Eilañ an isunanenn LH1 klok, hag implijout an UCSF Chimera “Docking Map Tool” evit stagañ en takad nann-model stag ouzh stankter LH1, ha goude-se reizhañ anezhi e Coot ; adc'hrit an argerzh betek ma vo bet modelet an holl isunanennoù LH1. Evit ar framm RC-LH114-W, dre dennañ an douester didalvoud er Coot, e vez rannet ar protein diouzh ar peurrest elfennoù nann-protein war gartenn USCF Chimera hag implijet e vez an ostilh Autobuild evit sevel ar patrom kentañ, hag an isunanennoù all (protein-W) Modeladur. E PHENIX (49). Ouzhpennit an heuliadoù mankout d'ar patrom disoc'h e Coot (48), ha goude-se reizhañ an isunanenn a-bezh dre zorn. Ar stankter hep rannañ a chom a glot gant ar c'hevreadur lipidoù (ID levraoueg monomeroù PDB CDL = CDL, POPC = 6PL ha POPG = PGT), diwaller β-DDM (LMT) ha molekulennoù UQ10 (U10). Implijit an optimizadur PHENIX (49) hag an optimizadur dre zorn e Coot (48) evit gwellaat ar patrom kentañ klok betek ma ne c'hallo ket stadegoù ar patrom ha kalite gwelet ar c'heflusker bezañ gwellaet muioc'h. Evit echuiñ, implijit LocScale (50) evit lemm ar gartenn lec'hel, ha goude-se grit meur a gelc'hiad all evit modelañ an douester nann-alouet hag an optimizadur emgefreek ha dre zorn.
Ar peptidoù, ar c'hofaktoroù hag al lipidoù hag ar c'hinonoù all stag ouzh o stankter a zo diskouezet e skeudennoù 1 ha 2. S18 betek S23. Diskouezet eo titouroù stadegel ar patrom diwezhañ e taolenn S1.
Ma ne vefe ket spisaet un dra all, e oa bet dastumet ar spektroù suniadur UV/Vis/NIR war ur spektrofotometr Cary60 (Agilent, SUA) gant etrefasoù 1 nm eus 250 nm da 1000 nm hag un amzer enframmañ a 0,1 s.
Diluiñ ar skouerenn en ur c'huvetenn kwarz gant un hent 2 mm betek A880 eus 1, ha dastum ar spektrum sunidigezh etre 400 ha 1000 nm. Dastumet e oa bet ar spektroù dikroek kelc'hiek war ur spektropolarimetr Jasco 810 (Jasco, Japan) gant etrefasoù 1 nm etre 400 nm ha 950 nm gant ur feur skaniñ a 20 nm min-1.
Termenet e vez ar c'heflusker diskar molar dre ziluziañ ar c'hemplezh diazez betek un A880 a war-dro 50. Diluziañ ar volum 10μl e 990μl tampon liammañ pe metanol, ha dastum ar spektrum sunidigezh diouzhtu evit digreskiñ an diskar BChl. Danvez BChl pep skouerenn metanol a oa bet jedet dre ar c'heflusker diskar da 771 nm a 54,8 mM-1 cm-1, ha termenet e oa bet ar c'heflusker diskar (51). Rannit ar c'hementad BChl muzuliet dre 32 (RC-LH114-W) pe 36 (RC-LH116) evit termeniñ ar c'hementad kemplezh diazez, a vez implijet neuze evit termeniñ spektrum sunañ ar memes skouerenn dastumet er c'hefluniadur Extinction buffer. kenstur. Tri muzuliadenn a-wechoù a voe graet evit pep skouerenn, hag ar c'hementad absorbañs keitat eus ar BChl Qy uhelañ a voe implijet evit ar jediñ. Ar c'heflusker diskar RC-LH114-W muzuliet da 878 nm a zo 3280±140 mM-1 cm-1, tra ma'z eo ar c'heflusker diskar RC-LH116 muzuliet da 880 nm 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 a oa bet muzuliet hervez an doare e (52). E berr gomzoù, HPLC fazenn enep (RP-HPLC) a oa bet kaset da benn gant ar reizhiad HPLC Agilent 1200. Dizoloit war-dro 0,02 nmol a RC-LH116 pe RC-LH114-W e 50 μl a 50:50 metanol:kloroform ennañ 0,02% (p/v) klor ferrik, ha lakait an Ultrasferenn Beckman Coulter rak-eilpennet 4 mml e-barzh 1-1-m. 40°C e dizoloer HPLC (80:20 metanol:2-propanol) war ur golonenn ×25 cm. Ober un elusion isokratek en un dizoloer HPLC evit evezhiañ an absorbañs da 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoidoù) ha 780 nm (BChl) e-pad 1 eurvezh. Enframmet e oa bet ar pik er c'hromatogramm 275 nm da 25,5 munutenn, ha ne oa ket ennañ kenaozadoù all a c'haller detektiñ. Implijet e vez an dachenn enframmet evit jediñ ar c'hementad molar a UQ10 tennet gant ar c'hrommenn kalibrañ jedet diwar ensinkladenn ar standardoù glan eus 0 da 5,8 nmol (Skeudenn S14). Pep skouerenn a oa bet dielfennet e teir adlavarenn, hag ar fazi embannet a glot gant SD ar c'hementad.
Un disoc'h ennañ ar c'hemplezh RC-LH1 gant un absorbadur Qy uhelañ a 0,1 a voe prientet gant 30 μM sitokrom c2 kalon marc'h digresketoc'h (Merck, Rouantelezh-Unanet) ha 0 da 50 μMUQ2 (Merck, Rouantelezh-Unanet). Tri skouerenn 1-ml a voe prientet e pep kresk UQ2 hag enkubet e-pad an noz en deñvalijenn da 4°C evit gwarantiñ un emdroadur klok d'an deñvalijenn a-raok ar muzuliañ. Karget e oa bet an disoc'h en ur spektrofotometr modulañ OLIS RSM1000 gant ur rouedad flamm 300 nm/500 linenn, 1,24 mm mont e-barzh, 0,12 mm e-kreiz ha 0,6 mm e-maez. Ur sil tremen hir 600 nm a vez lakaet e-tal mont e-barzh ar fototub skouerenn hag ar fotolieskementer dave evit dilemel ar gouloù eksitadur. Heuliet e oa bet an absorbañs da 550 nm gant un amzer enframmañ a 0,15 s. Skignet e vez ar gouloù eksitañ eus al LED 880 nm M880F2 (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., Rouantelezh-Unanet) dre ur c'habel fibr optek da 90% a nerzh dre ur c'hontroller DC2200 (Thorlabs Ltd., Rouantelezh-Unanet) hag a vez skignet d'ar font gouloù en ur c'horn a 90°. Enebet eo ar skin muzuliañ ouzh ar melezour evit distreiñ kement gouloù na oa ket bet lonket gant ar skouerenn da gentañ. Sellet ouzh an absorbañs 10 s a-raok ar sklêrijenn 50 s. Neuze e voe heuliet an absorbañs e-pad 60 s en deñvalijenn evit priziañ betek pelec'h e tigresk ar c'hinool ar sitokrom c23 + en un doare spontus (gwelet ar skeudenn S8 evit ar roadennoù c'hrouet).
Treuzfurmet e oa bet ar roadennoù dre lakaat ur feur kentañ linennek e-barzh 0,5 da 10 s (hervez ar c'hresk UQ2) ha keitat feur an tri skouerenn e pep kresk UQ2. Implijet e oa bet ar c'hementad RC-LH1 jedet gant ar c'hefluniadur diskar respektiv evit treiñ ar feur en efedusted katalitikel, treset e Origin Pro 2019 (OriginLab, SUA), ha lakaet e-barzh ar patrom Michaelis-Menten evit termeniñ ar gwerzhioù Km ha Kcat war a seblant.
Evit ar muzulioù absorbadur tremenet e oa bet diluet ar skouerenn RC-LH1 betek ~2μM e-barzh ur buffer IMAC ennañ 50 mM askorbat sodiom (Merck, SUA) ha 0,4 mM Terbutin (Merck, SUA). Implijet e vez an asid askorbek evel donezon elektronoù aberzh, ha tert-butaklofen evel harzer QB evit ma chomfe ar donezon RC pennañ digresket (da lâret eo, n'eo ket fotooksidet) a-hed an argerzh muzuliañ. War-dro 3 ml a skouerenn a vez ouzhpennet d'ur gellig troet personelaet (war-dro 0,1 m treuzkiz, 350 RPM) gant un hent optikel 2 mm evit ma vo amzer a-walc'h gant ar skouerenn en hent laser evit en em zerc'hel en teñvalijenn etre ar poulsoù eksitadur. Implijit polsoù laser ~100-fs evit kreñvaat ar reizhiad laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, SUA) evit lakaat ar skouerenn da 880 nm gant ur feur adlavaret a 1 kHz (20 nJ evit NIR pe 100 nJ evit Vis). A-raok dastum roadennoù, lakait ar skouerenn dindan gouloù an eksitadur e-pad war-dro 30 munutenn. An diskouezadeg a lakaio ar QA da vezañ diweredekaet (marteze e vo digresket ar QA ur wech pe ziv). Met notit mat e c'haller distreiñ d'an argerzh-mañ rak goude ur prantad hir a emdroadur teñval e tistroio RC tamm-ha-tamm d'an obererezh QA. Ur spektrometr Helios (Ultrafast Systems, SUA) a oa bet implijet evit muzuliañ spektroù tremen gant un amzer dale etre -10 ha 7000 ps. Implijit ar meziant Surface Xplorer (Ultrafast Systems, SUA) evit disrannañ an ensavadurioù roadennoù, ha goude-se kendeuziñ ha skoueriekaat. Implijit ar pakad meziantoù CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) evit implijout an hollad roadennoù kevredet evit kaout spektroù diforc'hel liammet ouzh an diskar, pe implijit ur fonksion a zastum meur a esponent gant respont ar benveg evit klotañ gant an emdroadur spektrel unvan en Origin (OriginLab, SUA).
Evel meneget a-us (53), e oa bet prientet ur film fotosintetek ennañ kemplezh LH1 hep antenn RC hag LH2 tro-dro. Diluet e voe ar grogenn e 20 mM tris (pH 8,0) ha goude-se e voe karget en ur c'huvetenn kwarz gant un hent optikel 2 mm. Ur poulz laser 30nJ a voe implijet evit lakaat ar skouerenn da 540 nm gant un amzer dale etre -10 ha 7000 ps. Treuzfurmiñ an hollad roadennoù evel deskrivet evit Rps. skouer pal.
Pelletet e voe ar grogenn dre greizennañ da 150 000 RCF e-pad 2 eurvezh da 4°C, ha goude-se e voe adlakaet e absorbañs da 880 nm e 20 mM tris-HCl (pH 8,0) ha 200 mM NaCl. Dizoloit ar grogenn en ur veskañ tamm-ha-tamm 2% (p/v) β-DDM e-pad 1 eurvezh en deñvalijenn da 4°C. Diluet e oa bet ar skouerenn e 100 mM karbonat trietilamoniom (pH 8,0) (TEAB; Merck, Rouantelezh-Unanet) betek ur c'hementad protein a 2,5 mg ml-1 (analizenn Bio-Rad). Treuzfurmiñ a reer muioc'h diwar an doare embannet a-raok (54), o kregiñ gant diluziañ 50 μg protein en un hollad a 50 μl TEAB ennañ 1% (p/v) laurat sodiom (Merck, Rouantelezh-Unanet). Goude sonikadur e-pad 60 s e voe digresket gant 5 mM tris(2-karboksietil)fosfin (Merck, Rouantelezh-Unanet) da 37°C e-pad 30 munutenn. Evit an S-alkiladur, enkubañ ar skouerenn gant 10 mM metil S-metilthiometansulfonat (Merck, Rouantelezh-Unanet) hag ouzhpennañ anezhañ diwar un diluz stok izopropanol 200 mM e-pad 10 munutenn e temperadur ar gambr. Graet e voe an digeriñ proteolitek dre ouzhpennañ 2 μg meskaj Lys-C tripsin/endoproteinaz (Promega UK) ha goret da 37°C e-pad 3 eurvezh. Tennañ a reer ar surfaktant laurat dre ouzhpennañ 50 μl etil asetat ha 10 μl 10% (v/v) trenkenn trifluoroasetek (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) ha dre vortexañ e-pad 60 s. Broudañ a reer an disparti fazennoù dre greizennañ da 15 700 RCF e-pad 5 munutenn. Hervez protokol ar c'henderc'her e oa bet implijet ur c'holonenn spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Rouantelezh-Unanet) evit aspirañ ha disalc'hañ gant evezh ar fazenn izelañ enni ar peptid. Goude bezañ sec'het dre greizennañ dre vakuum e voe teuzet ar skouerenn e 0,5% TFA ha 3% asetonitril, ha 500 ng a voe dielfennet dre gromatografiezh RP nanofluenn asambles gant spektrometriezh tolz en ur implijout arventennoù ar reizhiad displeget a-raok.
Implijit MaxQuant v.1.5.3.30 (56) evit anavezout ha muzuliañ ar proteinoù evit klask Rps. diaz roadennoù proteom palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Roadennoù proteomek ar spektrometriezh tolz a zo bet lakaet e ProteomeXchange Alliance dre ar sanailh kevelerien PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) dindan an anavezer roadennoù PXD020402.
Evit an dielfennañ dre RPLC asambles gant spektrometriezh tolz ionizadur elektrospray e oa bet prientet ar c'hemplezh RC-LH1 diwar Rps a seurt gouez. Gant an doare embannet a-raok (16), ar c'hementad protein produet e kelligoù palustris a oa 2 mg ml-1 e 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl ha 0,03% (p/v) β- (dielfennadur Bio-Rad) ) DDM. Hervez protokol ar c'henderc'her, implijit ur c'heflusker purification 2D (GE Healthcare, SUA) evit tennañ 10 μg a brotein dre an doare strinkañ, ha dizoloit ar skorn e 20 μl 60% (v / v) asid formek (FA), 20% (v / v) asetonitril ha 20% (v/v) dour. Pemp mikrolitrad a oa bet dielfennet dre RPLC (Dionex RSLC) asambles gant spektrometriezh tolz (Maxis UHR-TOF, Bruker). Implijit ur golonenn MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Rouantelezh-Unanet) evit an dispartiañ da 60°C ha 100μlmin -1, gant ur gradient a 85% (v / v) dizoloer A [0,1% (v / v) FA ha 0,02% (V/v) TFA dizoloadenn dour] da 5% Bv/v) [0,1%(v/v) FA ha 0,02%(v/v) e 90%(v/v) asetonitril TFA] Dre implijout ar font ionizadur elektrospray skoueriek hag ar baramezioù dre ziouer e-pad ouzhpenn 60 munutenn e vez tapet gant ar spektrometr tolz 100 da 2750 m/z (feur karg-tolz). Gant skoazell an ostilh FindPept (https://web.expasy.org/findpept/) eus ar porched bioinformatik ExPASy, kartennaouit ar spektrum tolz ouzh isunanennoù ar c'hemplezh.
Kreskiñ a reas ar c'helligoù e-pad 72 eurvezh dindan 100 ml gouloù NF-izel (10μMm-2 s-1), etre (30μMm-2 s-1) pe uhel (300μMm-2 s-1). Meziant M22 (meziant M22 ma vez lezet a-gostez ar sulfat amoniom ha ma vez erlec'hiet ar suksinat sodiom gant asetat sodiom) en ur voutailh 100 ml gant ur skramm (23). E-kerzh pemp kelc'hiad 30 s e voe perlezet perlez gwer 0,1 mikron gant ur feur volum a 1:1 evit lizañ ar c'helligoù ha freskaet war skorn e-pad 5 munutenn. An danvez dizoloet, ar c'helligoù didorr hag ar perlez gwer a voe tennet dre greizennañ da 16 000 RCF e-pad 10 munutenn en ur mikrosentrifugell war ar bank. Dispartiet e voe ar grogenn en ur rotor Ti 70.1 gant 100 000 RCF e 20 mM tris-HCl (pH 8.0) gant ur gradient sukroz 40/15% (p/p) e-pad 10 eurvezh.
Evel deskrivet en hor labour kent, immunodetektadur an tiked His war PufW (16). E berr gomzoù, ar c'hemplezh kreiz puraet (11,8 nM) pe ar grogenn ennañ ar memes kementad RC (termenet dre oksidadur o tennañ ar spektrum diforc'h digresketoc'h hag o klotañ gant ar garg war ar gel livet) e-barzh ur bufer kargañ 2x SDS (Merck, Rouantelezh-Unanet) diluet div wech. Dispartiet e voe ar proteinoù war ur gel NuPage bis-tris 12% (Thermo Fisher Scientific, Rouantelezh-Unanet). Ur gel a oa bet livet gant Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Rouantelezh-Unanet) evit kargañ ha gwelet an isunanenn RC-L. Treuzkaset e voe ar protein war an eil gel d'ur grogenn fluorid poliviniliden (PVDF) gweredekaet gant metanol (Thermo Fisher Scientific, Rouantelezh-Unanet) evit an immunoassay. Stanket e voe ar grogenn PVDF e 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v / v) Tween-20 ha 5% (p / v) poultr laezh skuilhet, ha goude-se e voe enkubet gant an enepkorf kentañ enep-His (e Dilute an enepkorf tris-HCl [50 mM Hp 7.6), 150 mM NaCl ha 0.05% (v/v) Tween-20] e 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, SUA) e-pad 4 eurvezh. Goude bezañ bet gwalc'het 3 gwech e-pad 5 munutenn e-barzh ur c'heflusker enepkorf, e voe kemmesket ar grogenn gant un enepkorf eilrenk enep-mousc'hoarzh (diluet 1:10 000 e-barzh ur c'heflusker enepkorf) ar c'horf-mor (Sigma-Aldrich, UK) (diluet 1:10 000 e-barzh ur c'heflusker enepkorf) Enkubañ evit ma c'hallje bezañ detektet (5 munutenn goude 3 gwalc'h e-barzh ur c'heflusker enepkorf) en ur implijout WAR EST 2000. substrad chemiluminescence (Cyanagen, Italia) hag Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Rouantelezh-Unanet).
Dre dresañ dasparzh nerzh pep hent gel livet pe immunoassay, en ur enframmañ an dachenn dindan ar pik ha jediñ ar feur nerzh etre RC-L (gel livet) ha Protein-W (immunoassay), e ImageJ (57) Treuzfurmiñ ar skeudenn. Ar c'heñveroù-se a oa bet amdroet e keñveroù molar dre gemer e kont e oa 1:1 ar c'heñver etre RC-L ha protein-W er skouerenn RC-LH114-W glan ha normalaat an holl roadennoù hervez.
Evit kaout dafar ouzhpenn evit ar pennad-mañ, kit da welet http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ur pennad digor eo, skignet dindan termenoù an Aotre-Implijout Creative Commons. Aotreet e vez gant ar pennad an implij, an dasparzh hag an adsevel hep strishadurioù e kement doare ma vo meneget an oberenn orin evel ma 'z eo dleet.
Evezhiadenn : Goulenn a reomp diganeoc'h reiñ ho chomlec'h postel nemet evit ma ouezo an hini a ginnigit war ar bajenn e fell deoc'h e vefe gwelet ar postel gantañ ha n'eo ket spam. Ne vo ket tapet chomlec'h postel ebet ganeomp.
Implijet e vez ar goulenn-mañ evit gwiriañ hag-eñ oc'h ur weladenner ha mirout ouzh an enporzhiañ stroboù ent emgefre.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Hicoil Necoil Necoil.
Struktur uhel-disoc'h ar c'hemplezh trap gouloù 1 er greizenn reaktadur a ginnig titouroù nevez war dinamik ar c'hinon.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Hicoil Necoil Necoil.
Struktur uhel-disoc'h ar c'hemplezh trap gouloù 1 er greizenn reaktadur a ginnig titouroù nevez war dinamik ar c'hinon.
©2021 Kevredigezh Amerikan evit Araokaat ar Skiantoù. an holl wirioù miret. AAAS zo ur c'hevread eus HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ha COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.