Bremañ *Chomlec'h bremañ : Köln 50931, Alamagn, Köln Enklask war ar respont d'ar stress kelligel e kleñvedoù liammet ouzh ar gozhni (CECAD).
Neurodegeneradur ar c'hleñvedoù mitokondriek a vez sellet outañ evel dic'hortoz rak bevennet eo plastikelezh metabolek an neuronoù, met n'eo ket komprenet mat efed an direizhder mitokondriel war emrenerezh kelligel ar metabolism neuronel er c'horf. Amañ e kinnigomp proteom spesadel ar c'helligoù eus neuronoù Purkinje gant un disterañ OXPHOS araokaet degaset gant dinamikoù kendeuziñ mitokondriek distrujet. Kavet hon eus e oa bet degaset gant an direizhder mitokondriel ur cheñchamant bras war dachenn ar proteomik, o kas a-benn ar fin d'an aktivadur heuliadel eus programmoù metabolek resis a-raok marv ar c'helligoù. Dic'hortoz hon eus termenet an enporzhiadur splann eus ar piruvat karboksilaz (PCx) ha peroksidazoù all liammet ouzh ouzhpennañ etreproduioù ar c'helc'hiad TCA. An harz ouzh PCx a lakae ar stress oksidativel hag an neurodistruj da greskiñ, ar pezh a ziskouez ez eus un efed gwareziñ gant an ateroskleroz war an neuronoù hep OXPHOS. Adtapout ar c'hevreadur mitokondriek en neuronoù dic'hortoz penn-da-benn a zistro penn-da-benn d'ar perzhioù metabolek-se, ha dre-se e vez miret ouzh marv ar c'helligoù. Gant hon disoc'hoù e vez anavezet hentoù dianav a-raok hag a ro resistañs d'an direizhder mitokondriek ha diskouez a reont e c'haller distreiñ d'an neurodegeneradur zoken e mareoù diwezhañ ar c'hleñved.
Pouezet eo perzh kreiz ar mitokondrioù evit mirout ar metabolism energiezh neuronel gant an arouezioù neurologel ledan a vez liammet ouzh kleñvedoù ar mitokondrioù denel. An darn vrasañ eus ar c'hleñvedoù-se a zo kaoz eus kemmoù genel a reol an eztaol genel mitokondriel (1, 2) pe distruj genel liammet ouzh dinamik ar mitokondri, hag a efed en un doare dieeun war stabilded an TDN mitokondriel (mtDNA) (3, 4). Labour war patromoù loened en deus diskouezet e c'haller gweredekaat hentoù metabolek mirour (5-7) evit respont da zireizhder ar mitokondrioù er gwiadoù tro-dro, ar pezh a ginnig titouroù pouezus war patogenez ar c'hleñvedoù kemplezh-se. Er c'hontrol-krenn, diazez eo hor c'homprenadur eus ar c'hemmoù metabolek e seurtoù kelligoù resis degaset gant fazi hollek ar produiñ adenozintrifosfat (ATP) mitokondriel en empenn (8), o lakaat war wel an ezhomm da anavezout palioù terapeutek a c'haller implijout evit diwall pe diwall ouzh ar c'hleñvedoù. Diwall ouzh an neurodistruj (9). An diouer a ditouroù eo ar fed ma vez sellet ouzh ar c'helligoù nervel evel ouzh ur soubidigezh metabolek bevennet-tre e-keñver ar seurt kelligoù eus ar gwiadoù tro-dro (10). Dre ma c'hoari ar c'helligoù-se ur perzh pennañ e kenurzhiañ pourvezadur ar metabolitoù d'an neuronoù evit brudañ an treuzkas sinaptek ha respont d'ar c'hleñvedoù ha d'ar c'hleñvedoù, eo tost bevennet d'ar c'helligoù glial ar galloud da azasaat metabolism ar c'helligoù d'ar c'hondisionoù diaes eus gwiadoù an empenn (11-14). Ouzhpenn-se, an diforc'h kelligel diazez eus gwiadoù an empenn a stank kalz studi ar c'hemmoù metabolek a c'hoarvez e isstrolladoù neuronel resis. Dre-se, n'eus ket kalz a draoù anavezet diwar-benn heuliadoù kelligel ha metabolek resis an direizhder mitokondriek en neuronoù.
Evit kompren heuliadoù metabolek an direizhder mitokondriek hon eus dizoloet neuronoù Purkinje (PN) e mareoù disheñvel an neurodistruj degaset gant distruj ar c'hevreadur diavaez mitokondriel (Mfn2). Daoust ma vez liammet ar c'hemmoù Mfn2 en dud gant un doare neuropatiezh skiantel hengounel anvet Charcot-Marie-Tooth doare 2A (15), an distruj a-ratozh eus Mfn2 er razhed zo un doare anavezet mat evit lakaat an dud da vezañ direizh. An isdoareoù neuronel liesseurt (16-19) hag ar fenotip neurodistrujus a zeu diwarno a vez heuliet gant sintomoù neurologel araokaet, evel an direizhderioù lusk (18, 19) pe an ataksia empenn (16). Dre implijout ur meskaj proteomik kementadel hep tikedenn (LFQ), metabolomik, skeudenniñ ha doareoù virologel e tiskouezomp e vez broudet kreñv an neurodegeneradur araokaet gant ar piruvat karboksilaz (PCx) hag ar faktoroù all a denn d'an arterioskleroz eus ar PNoù in vivo An eztaol enzimoù. Evit gwiriañ talvoudegezh an disoc'h-mañ hon eus digresket dreist-holl an eztaol PCx e PNoù hep Mfn2, ha kavet hon eus e oa bet gwashaet ar stress oksidativel gant an oberiadenn-se hag e oa bet buanaet an neurodegeneradur, o prouiñ evel-se e ro an azoospermiezh marv ar c'helligoù un emdroadur metabolek. Un eztaol strizh eus MFN2 a c'hell saveteiñ penn-da-benn ar PN a zigresk termenel gant un disterañ OXPHOS kreñv, ur gounezerezh bras a TDN mitokondriel, ha rouedad mitokondriek torret war a seblant, ar pezh a laka war wel muioc'h c'hoazh e c'hall ar stumm neurodistruj-se adtapout e stad araokaet ar c'hleñved a-raok marv ar c'helligoù.
Evit gwelet ar mitokondrioù e PNoù knockout Mfn2, hon eus implijet ur spesad logodenn a aotre ar mitokondrioù diouzh Cre da zibab an eztaol Cre eus ar protein fluoreskant melen (YFP) (mtYFP) (20) ha gwiriet hon eus morfologiezh ar mitokondrioù in vivo. Kavet hon eus e vefe kaset distruj ar gen Mfn2 e PNoù da rannadur tamm-ha-tamm ar rouedad mitokondriel (Skeudenn S1A), hag ar c'hemm kentañ a oa bet kavet da 3 sizhunvezh oad. Er c'hontrol, an diskar bras eus ar gwiskad kelligoù PN, evel m'eo diskouezet gant koll an imunolivañ Calbindin, n'eo ket kroget betek 12 sizhunvezh oad (Skeudenn 1, A ha B). An diforc'h amzer etre ar c'hemmoù kentañ e morfologiezh ar mitokondrioù hag an deroù gwelus eus ar marv neuronel a lakaas ac'hanomp da enklask war ar c'hemmoù metabolek degaset gant an direizhder mitokondriek a-raok marv ar c'helligoù. Savet hon eus ur strategiezh diazezet war ar renkañ kelligoù gweredekaet dre fluoresañs (FACS) evit distagañ PN a eztaol YFP (YFP+) (Skeudenn 1C), hag e logod kontroll (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), anvet CTRL (Skeudenn S1B). An optimizadur eus ar strategiezh gating diazezet war nerzh keñverel ar sinal YFP a ro tro deomp da glanaat korf YFP+ (YFPhigh) ar PNoù diouzh ar re n'int ket PNoù (YFPneg) (Skeudenn S1B) pe tammoù akson/dendritek fluoresket a c'hallfe bezañ (YFPlow; Skeudenn S1D, kleiz), kadarnaet gant mikroskop konfokal (Skeudenn S1D, dehou). Evit gwiriañ identelezh ar boblañs renket hon eus kaset da benn proteomikoù LFQ ha goude-se un analizenn elfennoù pennañ, ha kavet hon eus ez eus un disparti sklaer etre ar c'helligoù YFPhigh hag YFPneg (Skeudenn S1C). Ar c'helligoù YFPhigh a ziskouezas ur pinvidikaat net eus ar merkoù PNs anavezet (da lâret eo Calb1, Pcp2, Grid2 hag Itpr3) (21, 22), met pinvidikaat ebet eus ar proteinoù a vez eztaolet alies en neuronoù pe e seurtoù kelligoù all (Skeudenn 1D) ). Ur c'heñveriañ etre ar skouerennoù e kelligoù YFPhigh renket dastumet en arnodoù dizalc'h a ziskouezas ur c'heflusker keñveriañ> 0,9, ar pezh a ziskouez ur c'henderc'hadur mat etre an eiladennoù biologel (Skeudenn S1E). Evit diverrañ, ar roadennoù-se o deus gwiriekaet hor raktres evit an digenvezañ prim ha spesadel eus ar PN posupl. Dre ma vez broudet an adkempenn mosaik gant ar reizhiad sturier L7-cre implijet er sizhun gentañ goude ar gwilioud (23), hon eus kroget da lazhañ logod diwar CTRL ha da zastum neuronoù a-ratozh (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). Goude ma vo echuet an adkempenn e vez graet Mfn2cKO anezhañ da 4 sizhunvezh oad. Evel poent dibenn, hon eus dibabet 8 sizhunvezh oad pa oa ar gwiskad PN en e sav c'hoazh daoust d'an tammoù mitokondriek anat (Skeudenn 1B ha Skeudenn S1A). En holl, hon eus muzuliet 3013 protein en holl, war-dro 22% anezho diazezet war notennoù MitoCarta 2.0 diazezet war ar proteom mitokondriek evel mitokondrioù (Skeudenn 1E) (Skeudenn 1E) (24). An dielfennadur diforc'hel eus an eztaol genetek graet e sizhun 8 a ziskouezas ne oa nemet 10,5% eus an holl broteinennoù o doa kemmoù pouezus (Skeudenn 1F ha Skeudenn S1F), 195 protein anezho a oa bet reoliet war-gil ha 120 protein a oa bet reoliet war-zu an nec'h (Skeudenn 1F). Ret eo merkañ e tiskouez an “analizenn hentoù nevezus” eus ar strollad roadennoù-mañ e perc'henn ar genoù eztaolet en un doare disheñvel dreist-holl war ur strollad hentoù metabolek resis strishaet (Skeudenn 1G). Dedennus eo, daoust ma vez kadarnaet gant an digreskiñ eus an hentoù liammet ouzh OXPHOS ha sinal ar c'halsiom e vez degaset an direizhder mitokondriel e PNoù hep fusion, e vez reoliet kalz ar rummadoù all a denn dreist-holl da metabolism an asid amino, ar pezh a glot gant ar metabolism a c'hoarvez e PNoù mitokondriel. Kempoell eo an adkabellat. disfunksion.
(A) Luc'hskeudennoù kenfokal arouezius eus lodennoù empenn logod CTRL ha Mfn2cKO o tiskouez koll PNoù war-raok (calbindin, gris); nukleoù a oa bet eneplivet gant DAPI. (B) Kementadur (A) (dielfennadur un tu eus ar varregezh, ***P<0,001; n = 4 da 6 kelc'h diwar teir logodenn). (C) Red labour arnodel. (D) Dasparzh kartenn tommder ar merkoù resis evit Purkinje (uhelañ) ha seurtoù kelligoù all (kreiz). (E) Diagramm Venn a ziskouez an niver a broteinennoù mitokondriek anavezet er PN renket. (F) Skeudenn ar volkanoù eus ar proteinoù eztaolet en un doare disheñvel e neuronoù Mfn2cKO da 8 sizhunvezh (gwerzh troc'h talvoudegezh 1,3). (G) An analizenn hent krouiñ a ziskouez ar pemp hent reoliañ war-zu an nec'h (ruz) hag ar reoliañ war-zu an traoñ (glas) pouezusañ er PN Mfn2cKO renket evel 8 sizhunvezh. Diskouezet eo live eztaol keitat pep protein detektet. Kartenn tommder ar skalfad gris : talvoud P kemmet. ns, n'eo ket pouezus.
Roadennoù ar proteomek a ziskouezas e tigreske tamm-ha-tamm eztaol protein ar c'hemplezhioù I, III ha IV. An holl gemplezhioù I, III ha IV a endalc'he isunanennoù kodet gant mtDNA diazez, tra ma oa ar c'hemplezh II, a oa kodet dre nukleel hepken, hep bezañ gwallet dre vras ​​(Skeudenn 2A ha Skeudenn S2A). . Heñvel ouzh disoc'hoù ar proteomek, immunohistokimiezh ar rannoù gwiadoù cerebellek a ziskouezas e oa digresket tamm-ha-tamm live isunanenn MTCO1 (isunanenn 1 ar c'hitokrom C oksidaz mitokondriel) eus ar c'hemplezh IV e PN (Skeudenn 2B). Digreskiñ a rae kalz an isunanenn Mtatp8 kodet gant mtDNA (Skeudenn S2A), tra ma chome live stad stabil an isunanenn ATP sintaz kodet gant nukleel hep cheñch, ar pezh a glot gant ar c'hemplezh F1 isstrollad ATP sintaz stabil anavezet pa vez stabil an eztaol mtDNA. Kempoell eo ar stummadur. Troc'hañ (7). Priziañ live mtDNA er PNoù Mfn2cKO renket dre ar reaktadur enkadenn polimeraz e amzer gwirion (qPCR) a gadarnaas an digresk tamm-ha-tamm en niver a skouerennoù mtDNA. Keñveriet gant ar strollad kontroll, da 8 sizhunvezh oad, ne oa bet miret nemet war-dro 20% eus al live mtDNA (Skeudenn 2C). Heñvel ouzh an disoc'hoù-se, ar livadur dre mikroskopiezh kenfokal eus Mfn2cKO PNoù evit detektiñ an TDN a ziskouez ar gounezerezh nukleotidoù mitokondriel diouzh an amzer (Skeudenn 2D). Kavet hon eus ne oa bet reoliet war-zu an nec'h nemet lod eus ar c'hannaded a oa e-barzh an diskar proteinoù mitokondriel hag ar respont d'ar stress, en o zouez Lonp1, Afg3l2 ha Clpx, ha faktoroù asamblez kemplezh OXPHOS. N'eus bet kavet kemm pouezus ebet e liveoù ar proteinoù a gemer perzh en apoptoz (Skeudenn S2B). Heñvel, hon eus kavet n'eus nemet kemmoù bihan gant ar mitokondrioù hag ar c'hanolioù retikulom endoplasmek a gemer perzh en treuzdougen kalziom (Skeudenn S2C). Ouzhpenn-se, priziañ ar proteinoù liammet ouzh an otofagiezh n'en deus kavet kemmoù pouezus ebet, ar pezh a glot gant an induksion gwelus eus an otofagozomoù bet gwelet in vivo dre an imunohistokimiezh hag ar mikroskopiezh elektronek (Skeudenn S3). Koulskoude, an direizhder OXPHOS araokaet e PNoù a vez heuliet gant kemmoù mitokondriel ultrastrukturel anat. Gwelet e vez strolladoù mitokondriek e korfoù ar c'helligoù hag e gwez dendritek ar PNoù Mfn2cKO 5 ha 8 sizhunvezh o oad, hag ar framm diabarzh en deus bet kemmoù bras (Skeudenn S4, A ha B). Heñvel ouzh ar c'hemmoù ultrastrukturel-se hag ouzh un digresk bras en mtDNA, an analizenn eus troc'hadoù empenn a-vremañ gant ester metil tetrametilrodamin (TMRM) a ziskouezas e oa digresket kalz ar galloud membran mitokondriel e PNoù Mfn2cKO (Skeudenn S4C).
(A) Dielfennadur amzerel live eztaol ar c'hemplezh OXPHOS. Ne sellit nemet ouzh ar proteinoù gant P<0.05 da 8 sizhunvezh (ANOVA div du). Linenn strizh : kemm ebet e-keñver CTRL. (B) Kleiz : Ur skouer eus ur rann empenn merket gant enepkorf enep-MTCO1 (barrenn skeul, 20 μm). Goloet eo an dachenn dalc'het gant korfoù kelligoù Purkinje gant melen. A-zehou : Kementadur al liveoù MTCO1 (analizenn un tu eus ar c'hemmoù ; n = 7 da 20 kellig dielfennet diwar teir logod). (C) Analiz qPCR eus niver a skouerennoù mtDNA er PN renket (analiz un tu eus ar c'hemmoù; n = 3 da 7 logod). (D) Kleiz : Ur skouer eus un troc'h empenn merket gant un enepkorf enep-TDN (barrenn skeul, 20 μm). Goloet eo an dachenn dalc'het gant korfoù kelligoù Purkinje gant melen. A-zehou : Kementadur al lezioù mtDNA (dielfennadur un tu eus ar c'hemmoù ; n = 5 da 9 kellig eus teir logod). (E) Ur skouer eus ur rann empenn a-vremañ o tiskouez kelligoù mitoYFP + Purkinje (saezh) en un enrolladenn gant ur c'hlamp patch kellig a-bezh. (F) Kementadur ar c'hrommenn IV. (G) Enrolladennoù arouezius eus an enporzhiadur red dipolarizañ e kelligoù Purkinje CTRL ha Mfn2cKO. Roud uhelañ : ar pols kentañ en deus degaset AP. Roud izelañ : frekañs AP uhelañ. (H) Kementadur an enporzhiadurioù spontus postsinaptek (sPSPoù). Diskouezet eo an roud enrollañ arouezius hag e feur zoumañ e (I). An analiz un tu eus ar c'hemmoù a zielfennas n = 5 da 20 kellig eus teir logodenn. Diskouezet e vez ar roadennoù evel keitat±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0.001. (J) Roudoù arouezius eus an AP spontus enrollet dre implijout ar mod toull-klemm. Roud uhelañ : frekañs AP uhelañ. Roud a-is : zoumañ un AP hepken. (K) Muzuliañ ar frekañs AP keitat hag uhelañ hervez (J). test Mann-Whitney; n = 5 kellig a oa bet dielfennet diwar pevar logod. Diskouezet e vez ar roadennoù evel keitat±SEM; n'eo ket pouezus.
Distrujoù OXPHOS anat a oa bet detektet er Mfn2cKO PN 8 sizhunvezh, ar pezh a ziskouez eo direizh-kenañ arc'hwel fiziologel an neuronoù. Dre-se hon eus dielfennet perzhioù tredanel pasivel an neuronoù hep OXPHOS e-kerzh 4 pe 5 sizhunvezh ha 7 pe 8 sizhunvezh dre enrollañ ar c'hlamp patch kellig a-bezh e troc'hadoù cerebellar akut (Skeudenn 2E). Dic'hortoz e oa heñvel ar c'halloud keitat eus ar grogenn diskuizh hag ar resistañs mont e-barzh eus neuronoù Mfn2cKO ouzh ar re kontroll, daoust ma oa diforc'hioù soutil etre ar c'helligoù (Taolenn 1). Heñvel, da 4 pe 5 sizhunvezh oad, ne oa bet kavet kemm pouezus ebet er c'heñver red-voltazh (kromm IV) (Skeudenn 2F). Koulskoude, n'eus neuron Mfn2cKO ebet etre 7 ha 8 sizhunvezh o chom bev goude ar renad IV (pazenn hiperpolarizadur), ar pezh a ziskouez ez eus ur santidigezh sklaer ouzh ar galloud hiperpolarizadur er mare diwezhañ-mañ. Er c'hontrol, e neuronennoù Mfn2cKO, e vez gouzañvet mat ar redoù dipolarizañ a laka an diskargoù potentiel obererezh adlavaret (AP) da dalvezout, ar pezh a ziskouez n'eo ket disheñvel-tre o patromoù diskargañ hollek diouzh re an neuronennoù kontroll 8 sizhunvezh (Taolenn 1 ha Skeudenn 2G). Heñvel, frekañs hag ampled ar redoù postsinaptek spontus (sPSC) a oa keñverius ouzh re ar strollad kontroll, ha frekañs an darvoudoù a greskas eus 4 sizhunvezh da 5 sizhunvezh da 7 sizhunvezh da 8 sizhunvezh gant ur c'hresk heñvel (Skeudenn 2, H hag I). Ar prantad darevidigezh sinaptek e PNoù (25). Disoc'hoù heñvel a voe tapet goude patchoù PNs toullet. Ar c'hefluniadur-mañ a vir ouzh an digoll posupl eus fazioù ATP ar c'helligoù, evel ma c'hallfe c'hoarvezout en enrolladenn gant ar c'hlamp patch kelligoù a-bezh. Dreist-holl, n'eo ket bet gwallet potentiel ar grogenn diskuizh ha frekañs tennañ spontus an neuronoù Mfn2cKO (Skeudenn 2, J ha K). Evit diverrañ, an disoc'hoù-se a ziskouez e c'hall ar PNoù gant un direizhder OXPHOS anat talañ mat ouzh patromoù skarzhañ uhel-frekañs, ar pezh a ziskouez ez eus un argerzh digoll a aotre anezho da virout respontoù elektrofiziologel tost-normal.
Diskouezet e vez ar roadennoù evel keitat ± SEM (dielfennadur un tu eus ar c'hemm, test keñveriañ lies Holm-Sidak; *P<0.05). Merket eo niverenn an unanenn etre krommelloù.
Kroget hon eus da enklask hag-eñ e kaver hentoù a c'hell enebiñ ouzh an disterañ OXPHOS e-barzh ur rummad bennak er roadennoù proteomik (Skeudenn 1G), o tisplegañ evel-se perak e c'hall ar PN tapet mirout un elektrofisiologiezh tost-normal (Skeudenn 2, E da K). . An analizoù proteomek a ziskouezas e oa bet reoliet kalz an enzimoù a gemer perzh e katabolizm an aminoasidoù chadenn skourr (BCAA) (Skeudenn 3A ha Skeudenn S5A), hag ar produ diwezhañ asetil-CoA (CoA) pe suksinil CoA a c'hall ouzhpennañ an trikarboksilatoù e kelc'hiad asid arterioskleroz (TCA). Kavet hon eus e oa kresket an endalc'had BCAA transaminaz 1 (BCAT1) ha BCAT2 o-daou. Katalizet o deus ar pazenn gentañ eus katabolizm BCAA dre sevel glutamat diwar α-ketoglutarat (26). An holl is-unvezioù a ya d'ober ar c'hemplezh keto asid dehidrogenaz (BCKD) a chadenn skourrek a zo reoliet war-zu an nec'h (ar c'hemplezh a gataliz an dikarboksiladur da-heul ha dic'hortoz eus ar skeul karbon BCAA a zeu diwarni) (Skeudenn 3A ha Skeudenn S5A). Koulskoude, ne oa bet kavet kemmoù anat ebet e BCAA e-unan er PN renket, ar pezh a c'hellfe bezañ abalamour d'ar c'hresk eus an asid amino diazez-se pe d'an implij a fontoù all (glukoz pe asid laktek) evit klokaat ar c'helc'hiad TCA (Skeudenn S5B). Ar PNoù hep OXPHOS o deus diskouezet ivez kresk an obererezhioù disrannañ ha treuzaminañ glutamin da 8 sizhunvezh oad, ar pezh a c'haller diskouez dre reoliañ an enzimoù mitokondriel glutaminaz (GLS) ha glutamin piruvat transaminaz 2 (GPT2) (Skeudenn 3, A ha C). Ret eo merkañ eo bevennet ar reoliadur war-zu an nec'h eus GLS d'an izoform glutaminaz C (GLS-GAC) (kemm Mfn2cKO/CTRL a zo war-dro 4,5 gwech, P = 0,05), hag e reoliadur war-zu an nec'h spesadel e gwiadoù ar c'hrign-bev a c'hell skoazellañ ar bioenergiezh mitokondriel. (27).
(A) Ar gartenn tommder a ziskouez ar c'hemm pleg e live ar protein evit an hent spisaet da 8 sizhunvezh. (B) Skouer eus un troc'h empenn merket gant enepkorf enep-PCx (barrenn skeul, 20 μm). Ar bir melen a ziskouez korf ar gellig Purkinje. (C) Anavezout an eztaol protein dre amzer anavezet evel ur c'hannad pouezus evit an ateroskleroz (test t lies, *FDR <5%; n = 3-5 logod). (D) A-us : Ur skeudenn a ziskouez an doareoù disheñvel da vont e-barzh ar c'harbon merket a gaver en heulier piruvat [1-13C] (da lâret eo dre PDH pe dre hent treuz-arteriel). En traoñ : Diskouez a ra ar gartenn violoñs dregantad ar c'harbon merket unvan (M1) treuzfurmet en asid aspartik, asid sitrik hag asid maliek goude bezañ merket ar skourroù cerebellar akut gant [1-13C]piruvat (t-test par; ** P <0.01). (E) Dielfennadur klok eus istor an amzer eus an hent meneget. Ne sellit nemet ouzh ar proteinoù gant P<0.05 da 8 sizhunvezh. Linenn strizh : talvoud kemm ebet (dielfennadur div du eus ar c'hemmoù ; * P <0,05; *** P <0,001). Diskouezet e vez ar roadennoù evel keitat±SEM.
En hor studiadenn eo deuet katabolizm BCAA da vezañ unan eus an hentoù pennañ evit ar reoliañ war-zu an nec'h. Ar fed-se a ziskouez kreñv e c'hallfe ar volum aerborzhiañ a ya e-barzh ar c'helc'hiad TCA bezañ cheñchet e PN hep OXPHOS. Ur stumm pennañ eus adkempenn metabolek an neuronoù e c'hallfe bezañ, ar pezh a c'hallfe kaout un efed war fiziologiezh an neuroned hag ar surentez e-pad ma vez dalc'het un direizhder OXPHOS grevus. Hervez an hipotezenn-mañ, hon eus kavet e oa an enzim enep-aterosklerotek pennañ PCx war-zu an nec'h (Mfn2cKO/CTRL a cheñch war-dro 1,5 gwech ; Skeudenn 3A), ar pezh a gas an treuzfurmadur eus ar piruvat en oksaloasetat (28), a greder e vez eztaolet en empenn. (29, 30). Heñvel ouzh disoc'hoù ar proteomek, ar mikroskopiezh kenfokal a ziskouezas e oa kresket an eztaol PCx en un doare resis ha pouezus e PNoù hep OXPHOS, tra ma oa reaktivite PCx strishaet dreist-holl d'ar c'helligoù glial Bergmann tost eus ar c'hontroll (Skeudenn 3B). Evit testeniañ en un doare fonksionel ar c'hresk a-us d'ar PCx, hon eus tretet troc'hadoù cerebellar akut gant [1-13C]piruvat tracer. Pa oa bet oksidet ar piruvat gant ar piruvat dehidrogenaz (PDH), e oa aet e label izotop da get, met enkorfet e vez e-barzh etreproduioù ar c'helc'hiad TCA pa vez metabolizet ar piruvat dre reaktadennoù gwazhiedel (Skeudenn 3D). Evit skoazellañ hor roadennoù proteomek, hon eus gwelet un niver bras a varkoù eus an heulier-se en asid aspartik eus tammoù Mfn2cKO, tra ma oa an asid sitrik hag an asid malik ivez gant un tu etre, daoust ma ne oa ket pouezus (Skeudenn 3D).
E neuronoù dopamin al logod MitoPark gant un direizhder mitokondriek degaset gant neuronennoù dopamin o tistrujañ dreist-holl ar gen faktor treuzskrivañ mitokondriek A (Tfam) (Skeudenn S6B), e oa bet reoliet kalz an eztaol PCx ivez (31), ar pezh a ziskouez e vez reoliet an arterioskleroz dre asid aseton. OXPHOS er c'horf. Ret eo merkañ eo bet kavet e vez reoliet kalz an enzimoù dibar (32-34) a c'hell bezañ eztaolet en neuronoù a c'hell bezañ liammet ouzh an arterioskleroz e PNoù hep OXPHOS, evel ar c'harboksilaz propionyl-CoA (PCC-A), ar Malonyl-CoA a dreuzfurm ar propionyl-CoA e mito-CoA-CoA hag ar c'harboksilaz suksinel enzim 3 (ME3), a zo e roll pennañ adtapout ar piruvat diwar ar malat (Skeudenn 3, A ha C) (33, 35). Ouzhpenn-se hon eus kavet ur c'hresk pouezus en enzim Pdk3, a fosforila hag a ziweredeka PDH dre-se (36), tra ma ne oa bet detektet kemm ebet en enzim Pdp1 a laka PDH da vont en-dro pe er c'hemplezh enzim PDH e-unan (Skeudenn 3A). Evel-just, e PNoù Mern2cKO, e oa bet kreñvaet fosforiladur an isunanenn α1 α (PDHE1α) eus elfenn piruvat dehidrogenaz E1 ar c'hemplezh PDH e Ser293 (anavezet evit harzañ obererezh enzim PDH) (Skeudenn S6C) (Skeudenn S6C). N'eus ket a zarempred gant ar piruvat.
Erfin, hon eus kavet e oa bet reoliet kalz an hent dreist eus biosintez ar serin hag ar glisin, ar c'helc'hiad folat mitokondriel (1C) hag ar biosintez prolin (Skeudenn 1G ha Skeudenn S5C) e-pad an argerzh gweredekaat. Ar gwiadoù tro-dro a vez gweredekaet gant un direizhder mitokondriel (5-7). An analizoù kenfokal a skoazell ar roadennoù proteomek-se a ziskouezas e oa bet lakaet troc'hadoù cerebellel logod 8 sizhunvezh da serin hidroksimetiltransferaz 2 (SHMT2), un enzim pennañ eus ar c'helc'hiad folat mitokondriek, e PN gant OXPHOS mankout. Respont difenn pouezus (Skeudenn S5D). E 13 troc'h cerebellar akut goret gant CU-glukoz, an arnodoù heuliañ metabolek o deus kadarnaet muioc'h c'hoazh ar reoliadur war-zu an nec'h eus biosintez ar serin hag ar prolin, ar pezh a ziskouez e oa kresket flus an izoformoù karbon e serin ha prolin (Skeudenn S5E). Dre ma'z eo ar reaktadennoù broudet gant GLS ha GPT2 karget eus sintezenn ar glutamat diwar ar glutamin hag eus an treuzaminadur etre ar glutamat hag an α-ketoglutarat, e tiskouez o reoliadur war-zu an nec'h e vez muioc'h a c'houlenn glutamat gant an neuronoù hep OXPHOS . Er c'hontrol d'ar c'hemmoù-se, un dielfennadur proteomek eus astrozitoù ar c'hef eus logod Mfn2cKO spesadel PN a ziskouezas ne cheñche ket kalz an hentoù-se (en o zouez an holl antiperoksidazoù) en eztaol, ar pezh a ziskouez eo diuzet an adkas metabolek-mañ evit PN digresket (Skeudenn S6, D da G).
Evit diverrañ, an dielfennadurioù-se o deus diskouezet patromoù disheñvel-tre eus an aktivadur amzerel eus hentoù metabolek resis e PNoù. Daoust ma c'hall ar fonksionoù mitokondriel neuronel direizh kas d'an ateroskleroz abred ha d'an adkempenn 1C (Skeudenn 3E ha Skeudenn S5C), ha zoken da gemmoù rakwelet en eztaol ar c'hemplezhioù I ha IV, ne vez ar c'hemmoù e sintezenn ar serin de novo nemet er mareoù diwezhañ. Disfunksion OXPHOS (Skeudenn 3E ha Skeudenn S5C). An disoc'hoù-se a ziviz un argerzh heuliadel ma vez ar respont mitokondriek (kelc'hiad 1C) ha sitoplazmek (biosintez ar serin) degaset gant ar stress en un doare sinergel gant kresk an ateroskleroz e kelc'hiad TCA evit adkempenn ar metabolism neuronel.
PNoù 8 sizhunvezh oad hep OXPHOS a c'hell mirout un obererezh eksitadur uhel-frekañs ha tremen dre un adkevreadur metabolek pouezus evit digoll an direizhder mitokondriel. An dizoloadenn-mañ a laka war wel ur c'hoant dedennus e c'hallfe ar c'helligoù-se resev un embregadenn terapeutek evit distreiñ pe mirout ouzh an neurodistruj zoken er mare-mañ. Diwezhat. Diskoulmet hon eus ar c'hementad-se dre daou obererezh dizalc'h. Er c'hentañ doare hon eus savet ur vektor virus adeno-associated (AAV) diouzh Cre evit ma c'hallfe MFN2 bezañ eztaolet en un doare diuzet e PNoù hep OXPHOS in vivo (Skeudenn S7A). Gwiriekaet e voe an AAV a enrineg MFN2 hag ar gen mCherry (Mfn2-AAV) e sevenadurioù neuronoù kentañ in vitro, ar pezh a lakaas MFN2 da vezañ eztaolet en un doare diouzh Cre ha da saveteiñ ar morfologiezh mitokondriel, o viret evel-se an neuromutadur e neuronoù Mfn2cKO ( Skeudenn S7, D, B ha D). Da c'houde, hon eus kaset da benn arnodoù in vivo evit kas Mfn2-AAV 8 sizhunvezh d'ar c'horteks empenn Mfn2cKO ha logod kontroll, ha dielfennet hon eus logod 12 sizhunvezh (Skeudenn 4A). Mervel a reas al logod Mfn2cKO tretet (Skeudenn 1, A ha B) (16). An treuzkas virel in vivo a zegasas un eztaol diuzet eus PN e lod eus ar c'helc'hioù empenn (Skeudenn S7, G hag H). An ensinkladenn eus an AAV kontroll a eztaol mCherry hepken (Ctrl-AAV) n'en deus bet efed pouezus ebet war live an neurodistruj e loened Mfn2cKO. Er c'hontrol, an dielfennadur eus Mfn2cKOoù treuzkaset gant Mfn2-AAV a ziskouezas un efed gwareziñ pouezus eus ar gwiskad kelligoù PN (Skeudenn 4, B ha C). Dreist-holl e seblant bezañ tost diforc'hus stankter an neuronoù diouzh al loened kontroll (Skeudenn 4, B ha C, ha Skeudenn S7, H ha I). An eztaol MFN1 met n'eo ket MFN2 a zo ken efedus evit saveteiñ ar marv neuronel (Skeudenn 4C ha Skeudenn S7, C ha F), ar pezh a ziskouez e c'hall an eztaol MFN1 ektopik klokaat an diouer a MFN2 en un doare efedus. An analizoù all war live ar PN hepken a ziskouezas e oa bet saveteet dreist-holl ultrastruktur ar mitokondrioù gant Mfn2-AAV, e oa bet normalaet liveoù an mtDNA, hag e oa bet distroet an eztaol uhel eus ar merker enep-angiogenez PCx (Skeudenn 4, C da E ). Ur sell gwelet war al logod Mfn2cKO saveteet en ur stad diskuizh a ziskouezas e oa gwellaet o emzalc'h hag o sintomoù lusk (fiñv S1 da S3). Evit echuiñ, an arnodoù-se a ziskouez eo a-walc'h adlakaat MFN2 da c'houde e PNoù dister-kenañ en OXPHOS evit distreiñ ar gounezerezh mtDNA ha lakaat an ateroskleroz da greskiñ, ha dre-se e vez miret ouzh diskar an axonoù hag ar marv neuronel in vivo.
(A) Ur skeudenn a ziskouez ar programm arnodiñ evit enporzhiañ AAV a enrine MFN2 pa vez gweredekaet an hent metabol meneget. (B) Luc'hskeudennoù kenfokal arouezius eus troc'hadoù 12 sizhunvezh treuzkaset gant logod Mfn2cKO da 8 sizhunvezh ha merket gant enepkorf enep-Calbindin. A-zehou : Skeuladur ar neudennoù akson. 450 ha 75 μm eo ment zoom an aksonoù. (C) Kleiz : Kementadur stankter ar c'helligoù Purkinje er boukl treuzkas AAV (AAV+) (analizenn un tu eus ar c'hemmoù ; n = 3 logod). A-zehou : dielfennadur ar fokus mtDNA e PN treuzkaset e sizhun 12 (test t hep par ; n = 6 kellig eus teir logod). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Mikrografoù elektronek treuzkas arouezius eus PNoù ar rannoù empenn Mfn2cKO treuzkaset gant ar vektoroù viruz meneget. Ar maskl roz a ziskouez an dachenn dalc'het gant an dendritoù, hag ar c'harrez poentoù melen a ziskouez ar zoum kinniget a-zehou ; n a zastum an nukleüs. Barrenn skeul, 1μm. (E) a ziskouez ur skouer eus livadur PCx ​​e PN treuzkaset da 12 sizhunvezh. Barrenn ar skeul, 20μm. OE, dreist-emzalc'h; FC, cheñchamant plegañ.
Erfin, hon eus studiet pouez ar surentez kelligoù broudet gant ar peroksidaz e PNoù o deus bet un direizhder OXPHOS. Krouet hon eus mCherry o enrinegañ AAV-shRNA (ARN berr hairpin) o tarzhañ dreist-holl mRNA PCx al logodenn (AAV-shPCx), hag enporzhiet hon eus ar virus pe e c'hontroll skrammet (AAV-scr) e-barzh empenn logod Mfn2cKO. Graet e oa bet an ensinkladenn er pevare sizhunvezh oad (Skeudenn 5A) evit tizhout un diskar PCx ​​efedus e-pad ar prantad ma oa kresket an eztaol PCx (Skeudenn 3C) ha ma oa c'hoazh en e sav ar gwiskad kelligoù PN (Skeudenn 1A). Ret eo merkañ e vez kaset PCx (Skeudenn S8A) da greskiñ kalz ar marv PN, ar pezh a zo ar c'helc'h strishaet nemetañ eus ar c'hleñved (Skeudenn 5, B ha C). Evit kompren mekanizm an efedoù metabolek degaset gant up-reoladur PCx, hon eus studiet statud redoks ar PNoù goude ma oa bet diskaret PCx ha ma oa bet eztaolet war un dro ar biosensor optikel Grx1-roGFP2 dre AAV (Skeudenn S8, B da D) evit priziañ ar c'hemm keñverel eus ar c'hementad redox peptid glutation (383). Neuze, hon eus graet ur mikroskopiezh skeudenniñ bevañ dre fluoresañs daou foton (FLIM) e tammoù empenn akut Mfn2cKO 7 sizhunvezh oad pe littermates kontroll evit detektiñ kemmoù a c'hallfe bezañ e statud redox sitoplazmek goude bezañ gwiriekaet an doareoù FLIM (Skeudenn S8, E da G). An dielfennadur a ziskouezas ur c'hresk pouezus e stad oksidadur ur PN Mfn2cKO hepken hep eztaol PCx, ar pezh a zo disheñvel diouzh an neuronoù kontroll pe ar PNoù Mfn2cKO o eztaol shRNA skrammet hepken (Skeudenn 5, D hag E). Pa oa bet digresket an eztaol PCx e oa kresket dregantad ar PNoù Mfn2cKO o tiskouez ur stad oksidet-tre muioc'h eget teir gwech (Skeudenn 5E), ar pezh a ziskouez e oa bet miret galloud redoks an neuronoù digredus gant ar reolennadur PCx.
(A) Ur skeudenn a ziskouez an deiziataer arnodiñ evit enporzhiañ AAV a enrine shPCx pa vez gweredekaet an hent metabol meneget. (B) Luc'hskeudennoù kenfokal arouezius eus troc'hadoù empenn 8 sizhunvezh e logod Mfn2cKO treuzkaset ha merket gant enepkorf enep-kalsineurin da 4 sizhunvezh. Barrenn ar skeul, 450μm. (C) Kementadur stankter ar c'helligoù Purkinje e boukloù treuzkaset gant AAV (dielfennadur un tu eus ar c'hemmoù; n = 3 da 4 logod). Diskouezet e vez ar roadennoù evel keitat±SEM; ***P<0.001. (D) Skeudenn FLIM arouezius a ziskouez padelezh keitat ar PN 7 sizhunvezh o ezteurel ar sentr redox glutation Grx1-roGFP2 dindan an amzer arnodiñ spisaet. Keñver LUT (taolenn sellet) : etrefas amzer dreistbevañ (e pikoeilennoù). Barrenn skeul, 25μm. (E) An histogramm a ziskouez dasparzh talvoudoù bevañ Grx1-roGFP2 eus (D) (n=158 da 368 kellig e daou logod dindan pep stad). Ar grafik tro-dro a-us da bep histogramm : a ziskouez an niver a gelligoù gant talvoudoù padelezh kalz hiroc'h (ruz, oksidet) pe berroc'h (glas, digresket), a dremen 1 SD eus talvoud padelezh keitat e CTRL-AAV-scr. (F) Ar patrom kinniget a ziskouez efed gwareziñ an upregulation eus PCx neuronel.
En holl, ar roadennoù a ginnigomp amañ a ziskouez e c'hall an ad-emzalc'h MFN2 saveteiñ penn-da-benn PN araokaet gant un disterañ OXPHOS grevus, un digresk mtDNA grevus, hag ur morfologiezh heñvel ouzh an ista direizh-kenañ, o kinnig evel-se un araokadenn dalc'hus zoken e kleñvedoù araokaet. An neurodegeneradur a ginnig testenioù a c'haller distreiñ eus ar mare a-raok marv ar c'helligoù. Pouezet eo ar feur soubidigezh metabolek-se muioc'h c'hoazh gant galloud an neuronoù da lakaat an ateroskleroz da greskiñ (un adkas eus ar c'helc'h TCA), ar pezh a stank an eztaol PCx e PNoù hep OXPHOS hag a gresk marv ar c'helligoù, o c'hoari evel-se ur roll gwareziñ (Skeudenn 5F).
Er studiadenn-mañ hon eus kinniget testenioù e vez respont ar PNoù da zireizhder OXPHOS o vont tamm-ha-tamm d'an ateroskleroz kelc'hiad TCA dre an hent gweredekaat diforc'hel gweredekaet gant programmoù metabolek. Kadarnaet hon eus an dielfennadur proteomek gant meur a zoare kemplezh ha diskouezet hon eus pa vezont lakaet da dalvezout gant un disfonksion mitokondriek kreñv e vez gant an neuronoù un doare elastikelezh metabolek dianav a-raok. Da souezhañ ac'hanomp, n'eo ket dre ret merkañ an argerzh adkempenn a-bezh ar stad metabolek termenel a ya gant an neurodiskar tamm-ha-tamm ha dic'hortoz, met hor roadennoù a ziskouez e c'hallfe bezañ un neuron kempenn zoken er mare a-raok marv ar c'helligoù Mekanizm digoll fonksionel. Diskouez a ra an disoc'h-mañ ez eus gant an neuronoù ur feur plastikelezh metabolek bras er c'horf. Ar fed-se a brou e c'hall adlakaat MFN2 diwezhatoc'h distreiñ eztaol ar merkoù metabolek pennañ ha mirout ouzh an diskar PN. Er c'hontrol, harzañ a ra an ateroskleroz ha buanaat a ra an nervennoù. treuzrevel.
Unan eus an disoc'hoù dedennusañ en hor c'hlask eo e c'hall ar PNoù hep OXPHOS kemmañ metabolism ar c'helc'hiad TCA dre reoliañ an enzimoù a vroud an arterioskleroz dreist-holl. Un elfenn stank eus ar c'helligoù kankr eo an adkempenn metabolek, lod anezho a zalc'h war ar glutamin evit ouzhpennañ etreproduioù ar c'helc'hiad TCA evit produiñ kevatalioù digreskiñ, a gas an enkadenn analañ war-raok hag a zalc'h ar produiñ a-raok ar biosintez lipidoù ha nukleotidoù (39 , 40). Ur studiadenn nevez zo he deus diskouezet e vez adkevreet ar metabolism glutamin/glutamat un elfenn bouezus ivez e-barzh ar gwiadoù tro-dro a c'houzañv disfonksion OXPHOS (5, 41), ma vez diouzh tu mont e-barzh ar glutamin e-barzh ar c'helc'hiad TCA diouzh Abalamour da grevusded ar gwallzarvoud OXPHOS (41). ). Koulskoude, n'eus ket a brouennoù sklaer war heñvelder ebet etre plastikelezh metabolek neuronel ar c'horf hag e dalvoudegezh posupl e-keñver ar c'hleñved. En ur studiadenn in vitro nevez zo e oa bet diskouezet e c'halle an neuronoù kortikel kentañ lakaat ar poulloù glutamat da vont en-dro evit an neurotreuzkas, o broudañ dre-se ar metabolism oksidativel hag an ateroskleroz dindan stadoù stress metabolek (42). Ret eo merkañ e kreder e vez dalc'het sintezenn an oksaloasetat e neuronennoù greunennoù ar c'herebell sevenet dindan harz farmakologel an enzim suksinat dehidrogenaz eus ar c'helc'hiad TCA (34). Koulskoude, talvoudegezh fiziologel ar mekanikoù-se evit gwiadoù an empenn (lec'h ma kreder e vez bevennet an ateroskleroz d'an astrosited dreist-holl) en deus c'hoazh ur ster fiziologel pouezus (43). En degouezh-mañ e tiskouez hor roadennoù e c'hall ar PNoù gwallet gant OXPHOS er c'horf bezañ treuzkaset d'an diskar BCAA ha d'ar c'harboksiladur piruvat, a zo an daou font pennañ evit ouzhpennañ etreproduioù ar strollad TCA. Daoust ma'z eo bet kinniget ar c'hontribusion a c'hallfe bezañ eus katabolizm BCAA e metabolism energiezh an neuronoù, ouzhpenn perzh ar glutamat hag ar GABA evit an neurotreuzkas (44), n'eus ket c'hoazh a brouenn eus ar mekanikoù-se in vivo. Aes eo neuze soñjal e c'hallfe ar PNoù direizh digoll ent emgefre ar beveziñ etreproduioù TCA kaset gant an argerzh asimiladur dre greskiñ an ateroskleroz. Dreist-holl e c'hall bezañ ret kreskiñ PCx evit mirout ur goulenn kresket evit an asid aspartik, ar pezh a zo bet diskouezet e kelligoù o liesaat gant disfunksion mitokondriek (45). Koulskoude, hon dielfennadur metabolomek n'en deus diskouezet kemmoù pouezus ebet e live stad stabil an asid aspartik e PNoù Mfn2cKO (Skeudenn S6A), ar pezh a ziskouez, moarvat, an implij metabolek disheñvel eus an asid aspartik etre ar c'helligoù o liesaat hag an neuronoù goude-mitotek. Daoust ma chom da vezañ termenet ar mekanik resis a-fet reoliañ PCx en neuronoù direizh in vivo, hon eus diskouezet e c'hoari ar respont a-raok ar mare-se ur perzh pouezus evit mirout stad redoks an neuronoù, ar pezh a oa bet diskouezet en arnodoù FLIM war tammoù cerebellar. Dreist-holl, mirout ouzh ar PNoù da reoliañ PCx a c'hell kas d'ur stad oksidetoc'h ha buanaat marv ar c'helligoù. N'eo ket an aktivadur eus an diskar BCAA hag eus ar c'harboksiladur eus ar piruvat doareoù da zibab ar gwiadoù tro-dro d'an direizhder mitokondriek (7). Dre-se e seblant bezañ un elfenn bouezus evit an neuronoù hep OXPHOS, zoken ma n'int ket an elfenn nemeti, a zo pouezus evit an neurodistruj. .
Ur seurt kleñved neurodistrujus disheñvel eo ar c'hleñved-red hag a ziskouez peurliesañ evel ataksia hag a ra droug d'ar PNoù alies (46). Ar boblañs neuronoù-se a zo gwall ziaes da zistrujañ ar mitokondrioù rak o diskar diuzet e-barzh al logod a zo a-walc'h evit adsevel kalz eus ar sintomoù lusk a glot gant an ataksia spinoserebellek denel (16, 47, 48). Hervez ar c'heloù, ur patrom logodenn treuzgenek gant ur gen mutant a zo liammet ouzh an ataksia spinocerebellar denel hag en deus un direizhder mitokondriek (49, 50), ar pezh a laka war wel pouez studiañ heuliadoù an disterañ OXPHOS e PNPH. Dre-se eo dereat-kenañ distagañ ha studiañ ar boblañs neuronoù dibar-se en un doare efedus. Koulskoude, pa vez ar PNoù kizidik-kenañ ouzh ar gwask ha pa vezont ur perzh izel eus holl boblañs ar c'helligoù cerebellar, evit meur a studiadenn diazezet war an omics, ez eo diaes c'hoazh dispartiañ diuzet anezho evel kelligoù a-bezh. Daoust ma'z eo tost dibosupl tizhout un diouer a saotradur eus ar seurt kelligoù all (dreist-holl ar gwiadoù oadourien), hon eus kendeuzet ur pazenn disrannañ efedus gant FACS evit kaout un niver a-walc'h a neuronoù bev evit an analizañ proteomek a-is, ha kaout ur golo protein uhel a-walc'h (war-dro 3000 protein) e-keñver ar roadennoù a zo bremañ eus ar strollad cerebel a-bezh (155). Dre virout buhezegezh ar c'helligoù a-bezh, an doare kinniget amañ a ro tro deomp da wiriañ ar c'hemmoù en hentoù metabolek er mitokondrioù hepken, met ivez da wiriañ ar c'hemmoù en o c'henseurted sitoplazmek, ar pezh a glot gant implij pinvidikaat tikedennoù ar grogenn mitokondriel spesadel d'ar seurt kelligoù An doare nevez evit an niver a mitokondrioù kemplezh er gwiadoù (255, 25). N'eo ket liammet an doare-ober a zeskrivomp ouzh studi ar c'helligoù Purkinje hepken, met gallout a ra bezañ implijet aes evit kement seurt kellig evit diskoulmañ ar c'hemmoù metabolek en empenn klañv, en o zouez skouerennoù all eus an direizhder mitokondriel.
Erfin, hon eus anavezet ur prenestr terapeutek e-pad an argerzh adkempenn metabolek-mañ a c'hell distreiñ penn-da-benn ar sinoù pennañ eus ar stress kelligel ha mirout ouzh an diskar neuronel. Dre-se, kompren an efedoù fonksionel eus an adkas deskrivet amañ a c'hellfe reiñ titouroù diazez war an doareoù da bareañ evit mirout ar vuhezegezh neuronel e-pad an direizhder mitokondriel. Ezhomm zo eus enklaskoù da zont a-benn dielfennañ ar c'hemmoù e metabolism an energiezh e seurtoù kelligoù empenn all evit diskuliañ penn-da-benn an doare ma c'haller implijout ar pennaenn-se evit kleñvedoù neurologel all.
Deskrivet eo bet al logod MitoPark a-raok (31). Deskrivet eo bet logod C57BL/6N gant genoù loxP a-dal da Mfn2 a-raok (18) ha kroaziet gant logod L7-Cre (23). Neuze e voe kroaziet an diskennidi doubl heterozigot gant logod Mfn2loxP/Mfn2loxP homozigot evit sevel knockoutoù genoù spesadel Purkinje evit Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). En un isstrollad pareañ e oa bet lakaet an allel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) dre groazioù ouzhpenn (20). An holl argerzhioù loened a oa bet graet hervez ar c'hemennadennoù europat, broadel hag ensavadurel hag aotreet gant LandesamtfürNatur eus Umwelt ha Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen, Alamagn. Heuliañ a ra al labour war al loened ivez titouroù Kevredad Europat Kevredigezhioù Skiantoù al Loened Labourva.
Goude bezañ anesteziet disloc'hadur ar c'houzoug eus ar vaouez dougerez e vez distag an embrion logodenn (E13). Dizoloet e voe ar c'horteks e-barzh un dizoloadenn holen kempoell Hanks (HBSS) ouzhpennet gant 10 mM Hepes ha treuzkaset e voe war ar meziant Dulbecco's Modified Eagle's Medium ennañ papain (20 U/ml) ha cisteine ​​(1μg/ml). Enkubañ ar gwiad e DMEM) ha disrannañ anezhañ dre zigeriñ enzimek. Ml) da 37°C e-pad 20 munutenn, ha goude-se e vez moullet dre mekanik e DMEM ouzhpennet gant 10% a serum bovin fetal. Hadet e voe ar c'helligoù war goloioù gwer goloet gant polilizin gant ur stankter a 2×106 dre bladenn sevenadur 6 cm pe gant ur stankter a 0,5×105 kelligoù/cm2 evit an analizañ skeudenniñ. Goude 4 eurvezh e voe erlec'hiet ar meziant gant ur meziant hep serum Neurobasal ennañ 1% B27 ouzhpenn ha 0,5 mM GlutaMax. Neuze e voe miret an neuronoù da 37°C ha 5% CO2 a-hed an arnod, ha maget ur wech ar sizhun. Evit broudañ an adkempenn in vitro e voe implijet 3μl (plad sevenadur 24 poull) pe 0,5μl (pladenn 24 poull) eus ar vektor virus AAV9 da-heul evit tretañ an neuronoù d'an eil devezh in vitro : AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, niverenn katalog 105530-AAV9) hag AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, niverenn katalog 105545-AAV9).
Merket eo an TDN kempoell Mfn1 ha Mfn2 eus al logodenn (kavet diwar plasmid Addgene #23212 ha #23213, hervez an urzh) gant an heuliad V5 (GKPIPNPLLGLDST) er penn C, ha kendeuzet int gant mCherry e framm dre an heuliad T2A. Grx1-roGFP2 zo ur prof digant Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Dre erlec'hiañ ar c'hasedig tdTomato dre implijout doareoù klonañ hengounel e oa bet isklonet ar c'hasedig e-barzh ar skourr pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (niverenn dave Addgene 28306) evit sevel pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-G Vektoroù FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ha pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Ur strategiezh heñvel a oa bet implijet evit sevel ar vektor kontroll pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Evit sevel ar sevel AAV-shPCx e ranker kaout ur vektor AAV plasmid (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), ennañ an heuliad TDN a enrineg ar shRNA a denn d'al logodenn PCx (5′CTTTCGCTAGCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAGACTTAGA 3′) Dindan kontroll ar promoter U6 e vez implijet mCherry dindan kontroll ar promoter CMV. Produiñ a reer vektoroù AAV skoazell hervez titouroù ar c'henderc'her (Cell Biolabs). E berr gomzoù, implijit ur plasmid treuzkas a zoug mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) treuzkas kelligoù 29A-MFN2-V5, mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) pe Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) gen kodañ, hag ivez protein kapsid kodañ AAV1 ha plasmid plasmid pakañ protein ouzhpenn, dre implijout an doare fosfat kalziom. Ar surnatant virus c'hrouet a oa bet tapet dre kelc'hiadoù skorn-dizoloiñ en ur banne skorn sec'h/etanol ha lizet e oa bet kelligoù e-barzh holen tamponet gant fosfat (PBS). Purifiet e voe ar vektor AAV dre ultrasentrifugadur gradient iodixanol didalvoud (24 eurvezh da 32 000 troatad dre vunutenn ha 4°C) ha kenstrollet dre implijout ur sil kreizdredan ultra-15 Amicon. Titer genom AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 kopienn ar genom (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX a oa bet deskrivet a-raok (45), muzuliet gant PCR-q -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) hag AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Skrapañ a reer an neuronoù kentañ e PBS 1x yen-skorn, pelletañ, ha goude-se homogenizañ e 0,5% Triton X-100 / 0,5% dezoksikolat sodiom/tampon lizis PBS ennañ fosfataz hag harzer proteaz (Roche). Ar c'hementad protein a oa bet graet dre implijout an analizenn asid bicinchoninek (Thermo Fisher Scientific). Neuze e voe dispartiet ar proteinoù dre elektroforezenn gel SDS-poliakrilamid, ha goude-se e voe blotet war ur grogenn poliviniliden fluorid (GE Healthcare). Stankañ al lec'hioù nann-spisial ha gounit gant an enepkorf kentañ (gwelet an daolenn S1 evit gouzout hiroc'h) e laezh 5% e TBST (saline Tris-tamponet gant Tween), pazennoù gwalc'hiñ hag enepkorf eilrenk e TBST Gourveziñ. Gorviñ gant enepkorf kentañ e-pad an noz da +4°C. Goude bezañ gwalc'het, lakait an enepkorf eilrenk e-pad 2 eurvezh e temperadur ar gambr. Da c'houde, dre enkubañ ar memes blot gant un enepkorf enep-β-aktin, e voe kadarnaet ar memes kargadur. Detektañ dre dreuzfurmiñ d'ar c'himiolluminesañs ha dre greñvaat ar c'himiulminesañs (GE Healthcare).
An neuronoù hadet a-raok war goloioù gwer a oa bet staget gant 4% paraformaldehid (PFA)/PBS d'ar poent amzer spisaet e temperadur ar gambr e-pad 10 munutenn. Da gentañ e vez treuzfurmet ar goloioù gant 0,1% Triton X-100/PBS e-pad 5 munutenn e temperadur ar gambr, ha goude-se e-barzh ur buffer stankañ [3% albumin serum bovin (BSA)/PBS]. D'an eil deiz e voe gwalc'het ar goloioù gant un tampenn stankañ hag e voent goret gant an enepkorf eilrenk kenstaget gant ar fluorofor dereat e-pad 2 eurvezh e temperadur ar gambr ; a-benn ar fin e voe gwalc'het ar skouerennoù a-feson e PBS gant 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) a zo bet eneplivet ha goude-se e voe staget ouzh ar bladenn mikroskop gant Aqua-Poly/Mount.
Anesteziet e voe al logod (gour ha parezed) dre ensinklañ ketamin (130 mg/kg) ha xylazin (10 mg/kg) e-barzh ar c'hof ha roet e voent dindan ar c'hroc'hen gant un analgesik karprofen (5 mg/kg), ha lakaet e voent en ur benveg stereotaktek (Kopf) gant ur pakad tommder. Lakaat ar c'hreñvlec'h war wel hag implijout ur brouilhed dent evit mougañ al lodenn eus ar c'horteks cerebellar a glot gant an askorn mis (diwar al lambda : lost 1.8, 1 kostez, a glot gant al lobuloù IV ha V). Implijit un nadoz kromm evit krouiñ gant evezh un toull bihan er c'hlopenn evit mirout ouzh ar gwazhied a-is da zistrujañ. Neuze e vez enlakaet tamm-ha-tamm ar c'hapiler gwer tennet tamm-ha-tamm er mikro-toull (eus -1,3 da -1 war tu ventral an dura mater), ha 200 da 300 nl AAV a vez enporzhiet er mikro-enporzhier (Narishige) gant strinkennoù dorn (Narishige) meur a wech dindan gwask izel e-pad ur prantad amzer a 10 munutenn da 20 munutenn. Goude an ensavadur, lakait ar c'hapiler e-pad 10 munutenn all evit ma c'hallfe ar virus en em ledañ penn-da-benn. Goude ma vo tennet ar c'hapilarioù e vez gwisket ar c'hroc'hen gant evezh evit digreskiñ an enflammadur goulioù ha reiñ tro d'al loen da yac'haat. Tretet e voe al loened gant analgesikoù (caspofen) e-pad meur a zevezh goude an oberatadenn, e-pad an amzer-se e voe heuliet o stad korfel gant evezh ha goude-se e voent lazhet d'ar mare meneget. An holl argerzhioù a oa bet kaset da benn hervez ar c'hemennadennoù europat, broadel hag ensavadurel hag a oa bet aprouet gant LandesamtfürNatur eus Umwelt ha Verbraucherschutz, e Nordrhein-Westfalen, en Alamagn.
Anesteziet e voe al loened gant ketamin (100 mg/kg) ha xylazin (10 mg/kg), ha perfuzet e voe ar galon gant 0,1 M PBS da gentañ, ha goude gant 4% PFA e PBS. Dizoloet e voe ar gwiad ha staget e 4% PFA/PBS e-pad an noz da 4°C. Ur gontell vibrañ (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Aostria) a voe implijet evit prientiñ tammoù sagittal (50 μm tevder) eus an empenn stag e PBS. Nemet e vefe spisaet un dra all, e oa bet graet livañ ar rannoù o nijal frank evel deskrivet a-us (13) e temperadur ar gambr hag o veskañ. E berr gomzoù, da gentañ, e voe treuzwelus an tammoù bet tapet gant 0,5% Triton X-100/PBS e-pad 15 munutenn e temperadur ar gambr ; evit epitopoù zo (Pcx ha Shmt2), dre lakaat an tammoù e-pad 25 munutenn da dommañ e-pad 25 munutenn (PH 9) e-lec'h ar pazenn-mañ. Da c'houde e voe goret ar rannoù gant enepkorf kentañ (gwelet an daolenn S1) e-barzh ur c'heflusker stankañ (3% BSA/PBS) da 4°C e-pad an noz gant ur meskaj. An deiz war-lerc'h e voe gwalc'het ar rannoù gant ur c'heflusker stankañ hag e voent goret gant an enepkorf eilrenk kenstaget gant ar fluorofor dereat e-pad 2 eurvezh e temperadur ar gambr ; a-benn ar fin e voe gwalc'het mat ar rannoù e PBS, enep-livet gant DAPI, ha goude-se staget gant AquaPolymount War ur bladenn mikroskop.
Ur mikroskop konfokal skanañ laser (TCS SP8-X pe TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) pourvezet gant ul laser gouloù gwenn hag ul laser ultraviolet 405 diod a voe implijet evit skeudenniñ ar skouerenn. Dre eztaoliñ ar fluorofor ha dastum ar sinal gant Hybrid Detector (HyDs), e voe implijet ar meziant LAS-X evit dastum skeudennoù staget a-du gant ar samplañ Nyquist e mod heuliadel : evit ar panelloù nann-kementad eo ar sinaloù dinamek-kenañ (da skouer, e kelligoù somatikel hag e dendritoù) mtYPD FPD da zizoleiñ an niver a Hybrid Detectors e mod dehou mod). Arveret e vez ur c'heflusker etre 0,3 ha 6 ns evit digreskiñ an drekleur.
Skeudenniñ e-gwirion ar c'helligoù renket. Goude bezañ renket e-barzh ur metou Neurobasal-A ennañ 1% B27 ouzhpenn ha 0,5 mM GlutaMax, e voe hadet ar c'helligoù diouzhtu war skouerennoù gwer goloet gant poli-l-lizin (μ-Slide8 Mat eo, Ibidi, niverenn katalog 80826) , ha goude-se e voe miret da 37°C ha CO e-pad un eurvezh evit ma c'hallje ar c'hellig lezel renkañ. Skeudennaouiñ e amzer gwirion a oa bet graet war ur mikroskop konfokal skanañ laser Leica SP8 gant ur laser gwenn, HyD, ul liñsel eoul 63×[1.4 digor niverel (NA)] hag ur staj tommañ.
Anesteziet e voe al logodenn buan gant dioksidenn garbon ha dibennet, tennet e voe an empenn buan eus ar c'hlopenn, ha troc'het e voe e rann sagittal 200μm tevder (evit an arnod merkañ 13C) pe 275μm tevder (evit daou arnod foton) leuniet gant an dafar da-heul. Walldorf, Alamagn) a zo leuniet gant ar substansoù da-heul : 125 mM NaCl yen-skorn, leun a garbon (95% O2 ha 5% CO2) gant izel Ca2 + liñvenn empenn artifisiel (ACSF), 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfat sodiom, NaCl 2,5 mM, 25 mM gluz 0,5 mM CaCl2 ha 3,5 mM MgCl2 (gwask osmotek eus 310 da 330 mmol). Treuzkas an troc'hadoù empenn bet tapet en ur gambr rak-enkubañ ennañ muioc'h a Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfat sodiom, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoz, 10 mM ha 20 mM Ca. MgCl2) Medium) pH 7,4 ha 310 da 320 mmol).
E-pad an argerzh skeudenniñ e voe kaset an troc'hadoù en ur sal skeudenniñ gouestlet, hag an arnod a voe kaset da benn dindan perfusion ACSF didalvoud d'un temperadur kempouez eus 32° da 33°C. Ur mikroskop skanañ laser liesfoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) pourvezet gant ul liñsel Leica 25x (NA 0.95, dour), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) a voe implijet evit ar skeudenniñ dre skourr. Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM eus Grx1-roGFP2. Muzuliet e oa bet ar c'hemmoù e stad redoks sitoplazmek ar PNoù gant FLIM daou foton e tammoù empenn sagittal, ma oa bet taget ar PNoù gant ar biosensor Grx1-roGFP2. Er gwiskad PN e vez dibabet an dachenn prenañ war-dro 50 da 80 μm dindan gorre ar slice evit bezañ sur ez eus ur PN reizh (da lâret eo, an diouer a framm perlez pe kemmoù morfologel neuronel a-hed an dendritoù) hag ar sentr roGFP2 doubl pozitivel hag an AAV a enrineg shRNA PCx pe he heuliad kontrollañ he heuliad (pep hini o tisplegañ mCherry). Dastum skeudennoù unvan gant 2x zoom niverel [hirder gwagenn eksitadur : 890 nm ; 512 nm 512 piksel]. Detektañ : HyD diabarzh, strollad siloù fluorescein isothiocyanate (FITC)] ha keitat ar skeudennoù e-barzh 2 pe 3 munutenn a vez implijet evit ma vo dastumet fotonoù a-walc'h (1000 foton en holl) evit ar c'hrommenn. Sensibilitez ar sontenn Grx1-roGFP2 ha gwiriekaat an doareoù FLIM a oa bet graet dre evezhiañ talvoudegezh padelezh roGFP2 pa oa bet ouzhpennet 10 mM H2O2 diavaez d'an ACSF perfusion (evit kreskiñ an oksidadur, ar pezh a lakafe ar vuhez da greskiñ), ha goude-se ouzhpennañ 2 mM dithiothreit (digreskiñ ar feur digreskiñ, ar pezh a lakae digreskiñ ar vuhez) (Skeudenn S8, D da G). Implijit ar meziant FLIMfit 5.1.1 evit dielfennañ an disoc'hoù bet tapet, lakait ar c'hrommenn dispac'h esponentiel unvan eus ar skeudenn a-bezh da glotañ gant an IRF muzuliet (arc'hwel respont an ostilh), ha χ2 a zo war-dro 1. Evit jediñ padelezh ur PN hepken e oa bet treset ar maskl tro-dro d'ar c'horf nervel dre zorn, hag implijet e oa bet ur c'hementad padelezh evit pep maskl.
Dielfennadur ar c'halloud mitokondriek. Goude ma oa bet enkubet ar rann akut gant 100 nM TMRM ouzhpennet war-eeun d'an ACSF perfuzet e-pad 30 munutenn, e oa bet muzuliet ar c'hemmoù potentiel mitokondriek eus ar PNoù gant ur mikroskop daou foton. Skeudennaouiñ TMRM a oa bet graet dre eztaoliñ ar sonterez da 920 nm hag implijout HyD diabarzh (tetrametilrodamin izotiosianat : 585/40 nm) evit dastum sinaloù ; dre implijout ar memes hirder gwagenn eksitañ met dre implijout un HyD diabarzh disheñvel (FITC :525/50) evit skeudenniñ mtYFP. Implijit ar plug-in Image Calculator ImageJ evit priziañ barregezh ar mitokondrioù war live ar c'helligoù hepken. E berr gomzoù, arveret e vez an daveenn plug-in : sinal = min (mtYFP, TMRM) evit anavezout ar rannvro mitokondriel a ziskouez ar sinal TMRM e Purkinje Somali er skeudenn kenfokal unvan eus ar ganol a glot. Neuze e vez muzuliet gorread ar pikseloù er maskl a zeu diwarno, ha goude-se e vez normalaet war ar skeudenn unvan troc'h a glot gant ar ganol mtYFP evit kaout ar fraksion mitokondriel a ziskouez ar c'halloud mitokondriel.
Diverket eo bet ar skeudenn gant ar meziant Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Evit ar skeudennoù skannet eus an teulioù e vez graet ar c'hefluniadur eus un teul hepken dre implijout an algoritm gwriat emgefre pourvezet gant ar meziant LAS-X. Goude bezañ bet kalibret ar skeudennoù, implijit ImageJ hag Adobe Photoshop evit tretañ ar skeudenn pelloc'h ha reizhañ ar sklêrijenn hag ar c'hontrol en un doare unvan. Implijit Adobe Illustrator evit prientiñ ar grafikoù.
dielfennadur ar fokus mtDNA. An niver a lezioù mtDNA a oa bet muzuliet war tammoù cerebellek merket gant enepkorfoù a-enep an TDN dre ur mikroskop konfokal. Pep tachenn tarzh a oa bet krouet evit korf ar gellig ha nukleüs pep kellig, ha jedet e oa bet an dachenn a-fet enlugellad Multi Measure (ar meziant ImageJ). Tennit ar gorread nukleel diouzh gorread korf ar gellig evit kaout ar gorread sitoplazmek. Erfin, ar plug-in Analyze Particles (ur meziant ImageJ) a oa bet implijet evit muzuliañ ent emgefre ar poentoù TDN sitoplazmek a ziskouez mtDNA war ar skeudenn troc'h, hag an disoc'hoù bet tapet a oa bet normalaet ouzh keitat PN al logod CTRL. Diskouezet e vez an disoc'hoù evel an niver keitat a nukleozidoù dre gellig.
Dielfennadur an eztaol protein. Implijit enlugellad ImageJ's Image Calculator evit priziañ an eztaol protein e PN war live ar gellig unvan. E berr gomzoù, er skeudenn kenfokal unvan eus ar ganol a glot, dre an daveenn : sinal = min (mtYFP, enepkorf), e vez anavezet ar rannvro mitokondriel a ziskouez immunoreaktivelezh ouzh un enepkorf resis e Purkina. Neuze e vez muzuliet gorread ar pikseloù er maskl a zeu diwarno, ha goude-se e vez normalaet war ar skeudenn unvan troc'h a glot gant ar ganol mtYFP evit kaout ar fraksion mitokondriek eus ar protein diskouezet.
Dielfennadur stankter ar c'helligoù Purkinje. Ar plug-in Cell Counter eus ImageJ a oa bet implijet evit priziañ stankter Purkinje dre rannañ an niver a gelligoù Purkinje kontet dre hirder ar walenn empenn dalc'het gant ar c'helligoù kontet.
Prientiñ ha dastum ar skouerennoù. An empenn eus ar strollad kontroll hag al logod Mfn2cKO a oa bet fiziet e 2% PFA/2,5% glutaraldehid e 0,1 M tampon fosfat (PB), ha goude-se e voe prientet troc'hadoù koronal dre implijout ciliatoù (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Aostria) (Tevder 50 da 60 μm) An tampon fiziet e PB 1% tetraoksidenn ha ferrosianur potasiom 1,5% e gwrezverk ar gambr e-pad 1 eurvezh. Gwalc'het e voe ar rannoù teir gwech gant dour strilhañ, ha goude-se e voent livet gant 70% etanol ennañ 1% uranil asetat e-pad 20 munutenn. Neuze e voe dizouret ar rannoù en alkool renket ha enkorfet e resis epoksi Durcupan ACM (araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, niverenn katalog 14040) etre skouerennoù gwer goloet gant silikon, ha da 60°C e voent polimerizet er forn e-pad 48 eurvezh. Dibabet e oa bet tachenn ar c'horteks empenn ha troc'het e oa bet tammoù ultrafin 50 nm war Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Aostria) ha dibabet war ur gael 2×1 mm e kouevr goloet gant ur film polistiren. Livet e voe ar rannoù gant un disoc'h 4% uranil asetat en H2O e-pad 10 munutenn, gwalc'het gant H2O meur a wech, goude gant sitrat plom Reynolds en H2O e-pad 10 munutenn, ha goude-se gwalc'het gant H2O meur a wech. Tennet e oa bet mikrografoù gant ur mikroskop elektronek treuzkas Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) gant ur c'hamera niverel TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, SUA). Alamagn).
Evit al logod klañv gant AAV e voe dispartiet an empenn ha troc'het e-barzh ur rann sagittal 1 mm tevder, ha sellet e voe ouzh ar c'herebell dre implijout ur mikroskop fluoresañs evit anavezout ar walenn gloazet gant AAV (da lâret eo, mCherry o ezteurel). Implijet e vez nemet an arnodoù ma vez kaset gant an ensinkladenn AAV un efedusted treuzkas uhel-kenañ eus ar gwiskad kelligoù Purkinje (da lâret eo tost an holl gwiskad) e daou walenn cerebellar war-lerc'h da nebeutañ. Ar boukl treuzkaset gant AAV a voe mikrodiseket evit ur post-fiksadur a-hed an noz (4% PFA ha 2,5% glutaraldehid e 0,1 M tampon kokoat) ha treuzfurmet pelloc'h. Evit enkorfañ EPON e voe gwalc'het ar gwiad fiziet gant 0,1 M a c'hokaat sodiom (Applichem), hag enkoubaet gant 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) e 0,1 M a c'hokaot sodiom (Applichem) e-pad 4 eurvezh, ha goude-se e voe gwalc'het e-pad 2 eurvezh. Adc'hrit 3 gwech gant 0,1 M tampenn kokamid. Da c'houde e voe implijet an heuliad etanol o pignat evit gounit pep disoc'h etanol da 4°C e-pad 15 munutenn evit dizourañ ar gwiad. Treuzkaset e voe ar gwiad da oksidenn propilen ha goret e-pad an noz en EPON (Sigma-Aldrich) da 4°C. Lakaat ar gwiad en EPON fresk e temperadur ar gambr e-pad 2 eurvezh, ha goude-se enkorfañ anezhañ da 62°C e-pad 72 eurvezh. Implijit un ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) hag ur gontell diamant (Diatome, Biel, Suis) evit troc'hañ tammoù ultrafin 70 nm, ha livañ gant 1,5% uranil asetat e-pad 15 munutenn da 37°C, ha livañ gant un diluz sitrat plom e-pad 4 munutenn. Tennet eo bet ar mikrografoù elektronek gant ur mikroskop elektronek treuzkas JEM-2100 Plus (JEOL) pourvezet gant ur meziant Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) hag ur meziant DigitalMicrograph (Gatan). Evit an dielfennañ e oa bet tennet mikrografoù elektronek gant ur zoom niverel 5000× pe 10 000×.
Dielfennadur morfologel ar mitokondrioù. Evit an holl zielfennadurioù e oa bet treset dre zorn troioù-kaer ar mitokondrioù hiniennel e skeudennoù niverel dre implijout ar meziant ImageJ. Dielfennet e vez arventennoù morfologel disheñvel. Stankder ar mitokondrioù a vez eztaolet evel ur c'hresk dregantad dre rannañ gorread mitokondriel hollek pep kellig dre gorread ar sitoplazm (gorread ar sitoplazm = gorread ar c'hellig-gorread nukleus ar gellig) × 100. Rontder ar mitokondrioù a vez jedet gant ar formulenn [4π∙(gorread/perimetr 2)]. Morfologiezh an ista eus ar mitokondrioù a voe dielfennet ha rannet e div rummad ("tubular" ha "blister") hervez o stummoù pennañ.
Dielfennadur niver ha stankter an otofagosomoù/lizosomoù. Implijit ar meziant ImageJ evit tresañ dre zorn troioù-kaer pep otofagozom/lisozom er skeudenn niverel. Gorread an autofagosom/lizozom a vez eztaolet evel ur c'hresk dregantad dre rannañ gorread hollek framm an otofagosom/lisozom e pep kellig gant gorread ar sitoplazm (gorread ar sitoplazm=gorread ar gellig-gorread an nukleus)×100. Jedet e vez stankter an otofagozomoù/lizozomoù dre rannañ an niver hollek gant an niver a frammoù otofagosomoù/lizosomoù dre gellig (e-keñver gorread sitoplazmek) (gorread sitoplazmek = gorread kellig-gorread nukleel).
Tikedenniñ evit ar rannañ a-grenn hag ar prientiñ skouerennoù. Evit an arnodoù a c'houlenn tikedennañ glukoz, treuzkas an troc'hadoù empenn akut en ur gambr rakgoulzad, a endalc'h karbon sañset (95% O2 ha 5% CO2), Ca2 + ACSF uhel (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfat sodiom, 2,0 mM NaCl, 25 mM NaCl. d-glukoz, 1,0 mM CaCl 2 ha 2,0 mM MgCl 2, reizhet da pH 7,4 ha 310 da 320 mOsm), ma vez ar glukoz 13 C 6- erlec'hiañ glukoz (Eurisotop, niverenn katalog CLM-1396). Evit an arnodoù a c'houlenn tikedenniñ piruvat, treuzkas ar skourroù empenn akut da Ca2 + ACSF uheloc'h (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfat sodiom, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoz, 10 mM Ca.Cl ha 20 MM Ad. MgCl2, azasait da pH 7,4 ha 310 da 320mOsm), ha lakait 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, niverenn katalog CLM-1082). Gorviñ ar rannoù e-pad 90 munutenn da 37°C. E fin an arnod e voe gwalc'het ar rannoù buan gant un disoc'h dourek (pH 7,4) ennañ 75 mM karbonat amoniom, ha goude-se e voe homogenezet e 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: dour. Goude ma oa bet goret ar rannoù war skorn e-pad 30 munutenn e oa bet greizennet ar skouerennoù da 21 000 g e-pad 10 munutenn da 4°C, ha sec'het e oa bet ar surnatant sklaer en ur c'honsentradur SpeedVac. Ar pellet metabolit sec'h a voe miret da -80°C betek an analizañ.
Dielfennadur kromatografiezh liñvel-spektrometriezh tolz 13 asid amino merket gant C. Evit an dielfennadur kromatografiezh liñvel-spektrometriezh tolz (LC-MS) e oa bet adlakaet ar pellet metabolit e 75μl dour a live LC-MS (Honeywell). Goude bezañ bet greizennet da 21 000 g e-pad 5 munutenn da 4°C e voe implijet 20 μl eus ar surnatant sklaeraet evit an analizañ flus aminoasidoù, tra ma voe implijet ar peurrest eus an eztennañ diouzhtu evit an analizañ anionoù (gwelet amañ dindan). Graet e oa bet an analizenn asid amino dre implijout ar c'homenad derivatadur benzoil klorid deskrivet a-raok (55, 56). Er pazenn gentañ e voe ouzhpennet 10μl a 100 mM karbonat sodiom (Sigma-Aldrich) da 20μl a eztennañ metabolit, ha goude-se e voe ouzhpennet 10μl a 2% klorid benzoil (Sigma-Aldrich) d'an ACN a live LC. Ar skouerenn a voe vortexet ur pennadig ha goude-se e voe greizennet da 21 000 g e-pad 5 munutenn da 20°C. Treuzkas ar surnatant skarzhet en ur fiol 2 ml gant un ensoc'h gwer konikel (200 μl volum). Anavezout a reer ar skouerennoù dre implijout ar reizhiad LC ultra-uhel Acquity iClass (Waters) kevreet ouzh ar spektrometr tolz resis uhel Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Evit an dielfennañ e voe enporzhiet 2μl eus ar skouerenn deveret en ur bann 100×1.0 mm a silika T3 (Waters) ennañ 1.8μm a rannigoù. 100 μl/min eo ar feur red, hag ar reizhiad tampon a zo savet diwar tampon A (10 mM format amoniom ha 0,15% asid formek en dour) ha tampon B (ACN). Evel-henn eo ar c'hresk : 0%B da 0 munutenn ; 0%B. 0 da 15% B da 0 da 0,1 munutenn ; 15 da 17% B da 0,1 da 0,5 munutenn ; B da 17 da 55% da 0,5 da 14 munutenn ; B da 55 da 70% da 14 da 14,5 munutenn ; da 14,5 da 70 da 100% B da 18 munutenn ; 100% B etre 18 ha 19 munutenn ; 100 da 0% B da 19 da 19,1 munutenn ; 0% B da 19,1 da 28 munutenn (55, 56). Ar spektrometr tolz QE-HF a ya en-dro e mod ionizadur pozitivel gant ur rann tolz m/z (feur tolz/karg) eus 50 da 750. 60 000 eo an disoc'h arveret, ha 3×106 eo ar pal ionoù kontroll gounid (AGC), hag an amzer ionoù uhelañ a zo 10 milisekondenn. Ar font ionizadur elektro-spray tomm (ESI) a ya en-dro gant ur voltadur spray a 3,5 kV, ur gwrezverk kapiler a 250°C, ur red aer a 60 AU (unanennoù dibar), hag ur red aer skoazell a 20 AU. 250°C. Lakaet eo al liñsel S da 60 AU.
Kromatografiezh anion-Dielfennadur MS eus trenkennoù organek merket gant 13C. Ar skorn metabolit a chom (55μl) a voe dielfennet dre implijout ur reizhiad kromatografiezh ion Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) liammet ouzh ur spektrometr tolz QE-HF (Thermo Fisher Scientific). E berr gomzoù, 5μl a eztennañ metabolit a oa bet enporzhiet en ur golonenn Dionex IonPac AS11-HC pourvezet gant HPLC (2 mm×250 mm, ment ar rannigoù 4μm, Thermo Fisher Scientific) e mod boukl rannel pouezañ gant ur feur leuniañ a 1. )on. Dionex IonPac AG11-HC gward column (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Miret e vez temperadur ar c'holonenn da 30°C, ha lakaet eo an emsampler da 6°C. Implijit ur c'hartoñs hidroksid potasiom pourvezet gant dour diionizet evit sevel ur c'hresk hidroksid potasiom dre ar c'henderc'her eluent. Dispartiañ ar metabolitoù gant ur feur red a 380μl/min, en ur lakaat ar gradient da-heul da dalvezout : 0 da 3 munutenn, 10 mM KOH ; 3 da 12 munutenn, 10 da 50 mM KOH ; 12 da 19 munutenn, 50 da 100 mM KOH ; 19 da 21 munutenn, 100 mM KOH; 21 da 21,5 munutenn, 100 da 10 mM KOH. Adkempennet e voe ar golonenn dindan 10 mM KOH e-pad 8,5 munutenn.
Ar metabolitoù eluet a vez mesket gant ur red ouzhpenn izopropanol 150μl/min goude ar bann ha goude-se e vez kaset d'ur spektrometr tolz uhel o diarunusted o vont en-dro e mod ionizadur negativel. Emañ MS o evezhiañ ar c'hementad tolz eus m/z 50 da 750 gant ur resolution a 60 000. Lakaet eo an AGC da 1×106, ha miret eo an amzer ion uhelañ da 100 ms. Ar font ESI tommet a oa o vont en-dro gant ur voltadur strinkañ a 3,5 kV. Arventennoù all ar font ionoù a zo evel-henn : gwrezverk ar c'hapilar 275°C ; red gaz ar gouin, 60 AU; red gaz skoazell, 20 AU da 300°C, ha lakaat al liñsel S da 60 AU.
Dielfennadur roadennoù ar metabolitoù merket gant 13C. Implijit ar meziant TraceFinder (stumm 4.2, Thermo Fisher Scientific) evit dielfennañ roadennoù ar feur izotopoù. Gwiriekaet e oa bet identelezh pep kenaoz gant ur c'hevanaoz dave fiziañs ha dielfennet en un doare dizalc'h. Evit ober un dielfennadur pinvidikaat izotopoù e oa bet tennet gorread ar c'hromatogramm ion tennet (XIC) eus pep izotop 13C (Mn) eus [M + H] +, ma'z eo n niver karbon ar c'hevanaoz tarzh, implijet evit dielfennañ an asid amino pe [ MH] + evit dielfennañ an anionoù. Nebeutoc'h eget pemp lodenn dre vilion eo resisted tolz XIC, ha 0,05 munutenn eo resisted RT. Graet e vez an dielfennadur pinvidikaat dre jediñ ar c'heñver etre pep izotop detektet ouzh sammad holl izotopoù ar c'hevanaoz a glot gantañ. Roet e vez ar c'hementadoù-se evel talvoudoù dregantad evit pep izotop, hag an disoc'hoù a vez eztaolet evel pinvidikaat dregantad molar (MPE), evel deskrivet a-raok (42).
Ar pellet neuron skornet a voe homogenizet e metanol 80% (v/v) yen-skorn, vortexet, ha goret da -20°C e-pad 30 munutenn. Troc'hit ar skouerenn en-dro ha meskit da +4°C e-pad 30 munutenn. Kreizennet e voe ar skouerenn da 21 000 g e-pad 5 munutenn da 4°C, ha goude-se e voe dastumet ha sec'het ar surnatant a zeuas er-maez gant ur c'honsentradur SpeedVac da 25°C evit an analizañ da-heul. Evel deskrivet a-us, e oa bet graet un dielfennadur LC-MS war aminoasidoù ar c'helligoù renket. Gant TraceFinder (stumm 4.2, Thermo Fisher Scientific) e oa bet graet an dielfennadur roadennoù dre implijout tolz monoizotop pep elfenn. Graet e oa bet normalizadur ar roadennoù metabolit gant ar pakad meziantoù preprocessCore (57).
Prientiñ an tammoù. Anesteziet e voe al logodenn buan gant dioksidenn garbon ha dibennet, tennet e voe an empenn buan eus ar c'hlopenn, hag implijet e voe ar gontell vibrañ leun a skorn (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alamagn) evit e droc'hañ e rannoù sagittal 300 da 375 μm gant gazadur karbon ha 25% O Ca2 + ACSF izel (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfat sodiom, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoz, 1,0 mM CaCl2 ha 6,0 mM MgCl2 Adreizhañ da pH da 37 ha 30 mO). Treuzkas an troc'hadoù empenn bet tapet en ur gambr ennañ muioc'h a Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfat sodiom, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoz, 4,0 ml mM CaCl ha pH Ml 5 MC) 7,4 ha 310 da 320 mOsm). Mirout an tammoù e-pad 20 pe 30 munutenn evit ma c'hellfent bezañ adsavet a-raok enrollañ.
enrollañ. Implijet e voe evit an holl enrolladennoù ur leurenn mikroskop gant ur gambr enrollañ stag hag ul liñsel 20x dre soubañ en dour (Scientifica). Anavezet e oa bet ar c'helligoù Purkinje dre (i) ment ar c'horf, (ii) lec'hiadur anatomek ar c'hef, ha (iii) eztaol ar gen mtYFP fluoresket. Tennet e vez ar pipet gant ur resistañs beg eus 5 da 11 megohm gant ur c'hapiler gwer borosilikat (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Alamagn) hag ur pipet a-led Instruments (P-10000, Sutter, Notova, CA). An holl enrolladennoù a oa bet graet gant ur c'hreñvaer ELC-03XS npi patch clamp (npi electronic GmbH, Tam, Alamagn), a oa bet kontrollet gant ar meziant Signal (stumm 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Enrollet e oa bet an arnod gant ur feur samplañ a 12,5 kHz. Silet eo ar sinal gant daou sil Bessel tremen berr gant frekañsoù troc'h 1,3 ha 10 kHz hervez an urzh. Digollet e vez galloud ar grogenn hag ar pipet gant ar c'hevread digoll o implijout an amplifier. An holl arnodoù a oa bet graet dindan kontroll ur c'hamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Alamagn), a oa kontrollet gant ar meziant Hokawo (stumm 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alamagn).
Kefluniadur ha dielfennañ ar c'helligoù a-bezh reizhel. Kerkent a-raok enrollañ, leuniañ ar pipetenn gant an disoc'h diabarzh ennañ ar substansoù da-heul : 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM glukonat potasiom, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (MM), 5 mM trifosit Gun. (GTP) (Na) ha 10,0 mM fosfat kreatinin a oa bet kemmet da pH 7,25, hag ar gwask osmotek a oa 290 mOsm (sukroz). Kerkent ha lakaet un nerzh a 0 pA da dorriñ ar grogenn e voe muzuliet potentiel ar grogenn en ehan. Muzuliañ a reer ar resistañs mont e-barzh dre lakaat redoù hiperpolarizet a -40, -30, -20 ha -10 pA. Muzuliañ ment ar respont d'ar voltadur hag implijout lezenn Ohm evit jediñ ar resistañs mont e-barzh. Enrollet e voe an obererezh spontus en ur c'hlamp voltadur e-pad 5 munutenn, ha sPSC a voe anavezet ha muzuliet en Igor Pro (stumm 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, SUA) dre implijout ur skript anavezout hanter-emgefre. Muzuliañ a reer ar c'hrommenn IV hag ar red stad stabil dre stagañ ar pilenn da c'halloudoù disheñvel (adalek -110 mV) ha dre greskiñ ar voltadur e pazennoù 5 mV. Produiñ AP a oa bet amprouet dre implijout ur red dipolarizañ. Stankañ ar gellig da -70 mV en ur lakaat ur pols red dipolarizañ. Kemmañ ment pazenn pep unanenn enrollañ war-eeun (10 da 60 pA). Jediñ ar frekañs AP uhelañ dre gontañ dre zorn ar pikoù pols a laka ar frekañs AP uhelañ da greskiñ. An troc'h AP a vez dielfennet dre implijout an eil deverad eus ar pols dipolarizañ a laka da gentañ unan pe meur a AP da vont en-dro.
Kefluniadur ha dielfennañ ar patchoù toullet. Enrollañ ar patchoù toullet en ur implijout ar protokoloù skoueriek. Implijit ur pipetenn hep ATP ha GTP ha n'en deus ket ar c'hementadoù da-heul : 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA ha 2 mM MgCl2, ha lakait da pH 7,2 (o implijout KOH). ATP ha GTP a vez lezet kuit eus an disoc'h etrekellig evit mirout ouzh treuzdougen dic'houestlet ar grogenn gellig. Leuniet e vez ar pipetenn gant un disoc'h diabarzh ennañ amfoterisin (war-dro 200 da 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) evit kaout ur skrid eus ar patrom toullet. An amfoterisin a oa bet teuzet e dimetil sulfoksid (kementad diwezhañ : 0,1 da 0,3% ; DMSO ; D8418, Sigma-Aldrich). Ar c'hementad DMSO implijet n'en deus bet efed pouezus ebet war an neuronoù studiet. E-pad an argerzh pouezañ e oa bet heuliet dalc'hmat ar resisted kanal (Ra), ha kroget e oa bet an arnod goude ma oa bet stabilaet ampled Ra hag AP (20-40 munutenn). Muzuliañ a reer an obererezh spontus en ur c'hlamp voltadur ha/pe red e-pad 2 pe 5 munutenn. An analizañ roadennoù a oa bet graet gant Igor Pro (stumm 7.05.2, WaveMetrics, SUA), Excel (stumm 2010, Microsoft Corporation, Redmond, SUA) ha GraphPad Prism (stumm 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Stadoù-Unanet Amerika). Evit anavezout an APoù spontus e vez implijet enlugellad NeuroMatic v3.0c IgorPro. Anavezout ent emgefre an APoù dre implijout un troc'h roet, a vez kemmet hiniennel evit pep enrolladenn. Gant an etrefas spike, termeniñ frekañs ar spike gant ar frekañs spike uhelañ diouzhtu hag ar frekañs spike keitat.
Digenvezadur PN. Dre azasaat ouzh ar c'homenad embannet a-raok e oa bet puraet ar PNoù diouzh empenn al logodenn en ur mare resis (58). E berr gomzoù, ar c'herebell a voe disec'het ha troc'het e-barzh ur metou disrannañ yen-skorn [hep HBSS Ca2+ ha Mg2+, ouzhpennet gant 20 mM glukoz, penisilin (50 U/ml) ha streptomisin (0,05 mg/ ml)], ha goude-se e voe digeriñ ar metoù e-barzh papa [HBSS, ouzhpennet HBSS, gant stein (1 mg / ml), papain (16 U / ml) ha dezoksiribonukleaz I (DNase I; 0,1 mg/ml)] Treiñ e-pad 30 munutenn da 30°C. Da gentañ e vez gwalc'het ar gwiadoù e-barzh ur metou HBSS ennañ mucus vi (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ha DNase (0,1 mg/ml) da wrez ar c'hambr evit mirout ouzh an digeriñ enzimek, ha goude-se er metoù HBSS ennañ 20 mM glukoz Moulañ a-dost en HBSS peilin, peilin/ml/ml, strep (0,05 mg/ml) hag an DNase (0,1 mg/ml) a laosk kelligoù dibar. Silet e voe ar c'helligoù a zeuas er-maez dre ur sil kelligoù 70 μm, goude-se e voe pelletet ar c'helligoù dre greizennañ (1110 troatad dre vunutenn, 5 munutenn, 4°C) hag adstaget e vezont en ur metoù renkañ [HBSS, ouzhpennet gant 20 mM glukoz, 20% bovin fetal ) Serum pelinik (50/0/5) (0,05 mg/ml)]; priziañ buhez ar c'helligoù gant iod propidium ha reizhañ stankter ar c'helligoù da 1×106 da 2×106 kelligoù/ml. A-raok ar c'hitometriezh dre red e oa bet silet ar c'heflusker dre ur siler kelligoù 50 μm.
Sitometr red. Urzhiañ ar c'helligoù a oa bet graet da 4°C gant ar meziant FACSAria III (BD Biosciences) hag ar meziant FACSDiva (BD Biosciences, stumm 8.0.1). Renket e oa bet ar c'helligoù dre implijout ur skourr 100 μm dindan ur gwask a 20 psi gant ur feur a ~2800 darvoud/eilenn. Dre ma ne c'hell ket ar c'hriterioù hengounel (ment ar c'helligoù, an diforc'hidigezh bimodel, ha perzhioù skignañ) gwarantiñ an digenvezadur reizh eus PN diouzh ar seurtoù kelligoù all, e vez lakaet ar strategiezh toullañ diwar keñveriañ reizh an nerzh hag an emfluoresañs YFP e mitoYFP+ ​​hag e logod mitoYFP − kontroll. YFP a vez broudet dre skinañ ar skouerenn gant ul linenn laser 488 nm, ha detektet e vez ar sinal dre implijout ur sil tremen bann 530/30 nm. E logod mitoYFP+ ​​e vez implijet nerzh keñverel ar gen Rosa26-mitoYFP evit diforc'hañ korf neuronel ha tammoù akson ivez. 7-AAD a vez broudet gant ul laser melen 561 nm ha detektet gant ur sil tremen-bandenn 675/20 nm evit skarzhañ ar c'helligoù marv. Evit dispartiañ an astrosited war un dro e voe livet ar c'helligoù gant ACSA-2-APC, goude-se e voe skinet ar skouerenn gant ul linenn laser 640 nm, hag ur sil tremen-bandenn 660/20 nm a voe implijet evit detektiñ ar sinal.
Ar c'helligoù dastumet a voe pelletet dre greizennañ (1110 rpm, 5 munutenn, 4°C) ha miret da -80°C betek o implij. Rummataet e vez al logod Mfn2cKO hag o c'hoadoù d'ar memes devezh evit digreskiñ ar c'hemmoù argerzh. Kinnig ha dielfennañ roadennoù FACS a oa bet graet gant ar meziant FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, SUA).
Evel meneget a-us (59), ar PCR e amzer gwirion a vez implijet evit distagañ an TDN diouzh an neuronoù renket evit ar c'hantaouiñ mtDNA da-heul. Ar linennegezh hag ar santidigezh troc'h a oa bet amprouet da gentañ dre ober qPCR war niveroù disheñvel a gelligoù. E berr gomzoù, dastum 300 PN en ur buffer lysis ennañ 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 ha proteinaz K (200 ng/ml) ha gouennañ da 55°C 120 munutenn. Goret e voe ar c'helligoù da 95°C e-pad 10 munutenn evit ma vefe diweredekaet penn-da-benn ar proteinaz K. Gant ur sontenn TaqMan (Thermo Fisher) spesadel da mt-Nd1 e voe muzuliet an mtDNA dre PCR hanter-kementad er reizhiad PCR 7900HT Real-Time (Thermo Fisher Fiscients). Skiant, niverenn katalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, niverenn katalog AIVI3E8) ha 18S (Thermo Fisher Scientific, niverenn katalog Hs99999901_s1) gened.
Prientiñ skouerennoù proteom. Dre dommañ an disoc'h da 95°C e-pad 10 munutenn ha dre sonikaat, er buffer lizis [6 M klorid guanidin, 10 mM klorid fosfin tris(2-karboksietil), 10 mM kloroasetamid ha 100 mM tris-lyse skornet neuronennoù e HC]. War Bioruptor (Diagenode) e-pad 10 munutenn (30 eilenn poulz / 30 eilenn paouez). Diluet e voe ar skouerenn 1:10 e 20 mM tris-HCl (pH 8,0), mesket gant 300 ng aour tripsin (Promega), ha goret e-pad an noz da 37°C evit tizhout un digeriñ klok. D'an eil devezh e voe greizennet ar skouerenn da 20 000 g e-pad 20 munutenn. Diluet e voe ar surnatant gant 0,1% asid formek, ha dizoloet e voe an disoc'h gant StageTips savet e-unan. Sec'het e voe ar skouerenn en ur benveg SpeedVac (keflusker Eppendorf mui 5305) da 45°C, ha goude-se e voe lakaet ar peptid en asid formek 0,1%. An holl skouerennoù a oa bet prientet war un dro gant an hevelep den. Evit dielfennañ skouerennoù astrosited e oa bet merket 4 μg a beptidoù diholen gant ur merk tolz tandem (TMT10plex, niverenn katalog 90110, Thermo Fisher Scientific) gant ur c'heñver etre peptid ha TMT a 1:20. Evit merkañ an TMT e voe adlakaet 0,8 mg a reagent TMT e 70 μl a ACN didour, hag ar peptid sec'h a voe adkempennet e 9 μl a 0,1 M TEAB (bikarbonat trietilamoniom), ma voe ouzhpennet 7 μl a reagent TMT en ACN. Ar c'hresk a oa 43,75%. Goude 60 munutenn enkubadur e voe mouget ar reaktadur gant 2 μl a hidroksilamin 5%. Dastumet e voe ar peptidoù merket, sec'het, adlakaet e 200μl a asid formek (FA) 0,1%, rannet e daou, ha goude-se dizoloet gant StageTips savet ganto o-unan. Gant ur c'hromatograf liñvel UltiMate 3000 (kromatograf liñvel UltiMate 3000) e oa bet fraksionet unan eus an div hanterenn war ur golonenn kromatografiezh Acquity 1mm x 150mm leuniet gant rannigoù C18 130Å1.7μm (Waters, katalog N° SKU: 1966). Thermo Fisher Scientific). Dispartiañ ar peptidoù gant ur feur red a 30μl/min, dispartiañ eus 1% da 50% tampon B e-pad 85 munutenn gant ur gradient pazennek a 96 munutenn, eus 50% da 95% tampon B e-pad 3 munutenn, goude 8 munutenn evit tampon B 95 % ; Ar tampon A a zo 5% ACN ha 10 mM bikarbonat amoniom (ABC), hag ar tampon B a zo 80% ACN ha 10 mM ABC. Dastum ar fraksionoù bep 3 munutenn ha lakaat anezho e div strollad (1 + 17, 2 + 18, hag all) ha sec'hañ anezho en ur greizenn-dre-lien.
Dielfennadur LC-MS/MS. Evit ar spektrometriezh tolz e oa bet dispartiet ar peptidoù (niverenn r119.aq) war ur golonenn dielfennañ PicoFrit 25 cm, 75 μm treuzkiz diabarzh (liñs nevez, niverenn lodenn PF7508250) pourvezet gant 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQD medium (Maischr, Maisch-YAS), Maisch-YAS. 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alamagn). Miret e oa bet ar golonenn da 50°C. Ar tamponoù A ha B a zo 0,1% asid formek en dour ha 0,1% asid formek en 80% ACN, hervez o urzh. Dispartiet e voe ar peptidoù gant ur gradient pazenn-ha-pazenn a 200 nl/min eus 6% da 31% tampon B e-pad 65 munutenn, hag eus 31% da 50% tampon B e-pad 5 munutenn. Ar peptidoù eluet a voe dielfennet war ur spektrometr tolz Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Ar muzuliañ m/z a-raok ar peptid a vez graet gant ur resolution a 120 000 etre 350 ha 1500 m/z. Gant 27% a energiezh stokadenn normalaet e vez dibabet ar prekursor kreñvañ gant ur stad karg eus 2 da 6 evit ar c'hrouiñ disrannañ trap C energiezh uhel (HCD). Lakaet eo amzer ar c'helc'hiad da 1 eilenn. Muzuliañ a reer talvoud m/z an tamm peptid en trap ionoù dre implijout ar pal AGC bihanañ a 5×104 hag an amzer ensinklañ uhelañ a 86 ms. Goude ar rannadur e voe lakaet ar rakger war ar roll distaoliñ dinamek e-pad 45 s. Dispartiet e voe ar peptidoù merket gant TMT war ur golonenn Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, niverenn katalog 164942), hag ar spektroù divroañ a voe dielfennet war ur spektrometr tolz Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) pourvezet gant gwagennoù uhel (IMS) an dafar (Thermo Fisher Scientific) a ya en-dro gant daou voltadur digoll a −50 ha −70 V. Implijet e vez MS3 dibabet diwar ar raktres sinkronelaat evit muzuliañ ar sinal ion TMT. Graet e oa bet an disparti peptidek war EASY-nLC 1200, en ur implijout un elusion gradient linennek 90%, gant ur c'honsentradur tampon eus 6% da 31% ; ar tampon A a oa 0,1% FA, hag ar tampon B a oa 0,1% FA ha 80% ACN. Ober a ra ar golonenn dielfennañ da 50°C. Implijit FreeStyle (stumm 1.6, Thermo Fisher Scientific) evit rannañ ar restr orin hervez ar voltadur digoll FAIMS.
Anavezout ha muzuliañ ar proteinoù. Gant al lusker enklask Andromeda enframmet e oa bet dielfennet ar roadennoù orin gant MaxQuant stumm 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Ouzhpenn an heuliadoù Cre recombinase ha YFP bet tapet diwar Aequorea victoria e oa bet klasket spektroù an tammoù peptid evit an heuliad kanonikel hag an heuliad izoform eus ar proteom dave (Proteome ID UP000000589, pellgarget diwar UniProt e miz Mae 2017). Oksiderezh ar metionin hag an asetiladur N-termenel protein a oa bet lakaet evel kemmoù kemmus ; metiladur ar c'histein fikarbamoil a oa bet lakaet evel kemmoù fiziet. Ar baramezioù digeriñ a zo lakaet da "spesifikelezh" ha "tripsin/P". An niver izelañ a beptidoù ha peptidoù razor implijet evit anavezout ar proteinoù a zo 1; an niver izelañ a beptidoù dibar a zo 0. Dindan an doareoù da geñveriañ kartennoù peptidoù e oa 0,01 ar feur anavezout protein. Gweredekaet eo an dibarzh "Eil peptid". Implijit an dibarzh "match between runs" evit treuzkas anavezadennoù a-feson etre restroù orin disheñvel. Implijit ar c'hontadennoù feur izelañ LFQ 1 evit ar c'hantaouiñ hep tikedenn (LFQ) (60). Silet e vez an nerzh LFQ evit daou dalvoud reizh da nebeutañ en ur strollad genotipoù da nebeutañ e pep poent amzer, hag eztennet e vez diwar un dasparzh normal gant ul ledander a. 0.3 ha digreskiñ 1.8. Implijit ar bladenn urzhiataerezh Perseus (https://maxquant.net/perseus/) ha R (https://r-project.org/) evit dielfennañ disoc'hoù an LFQ. Implijet e oa bet un test t etre div-hent eus ar pakad meziantoù limma evit an dielfennadur eztaol diforc'hel (61). An analizañ roadennoù ergerzhel a vez graet gant ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ha pheatmap. Ar roadennoù proteomek diazezet war TMT a oa bet dielfennet gant MaxQuant stumm 1.6.10.43. Klask roadennoù proteomek c'hrouet eus diaz roadennoù proteomek mab-den UniProt, a oa bet pellgarget e miz Kerzu 2018. En dielfennadur emañ ar faktor reizhañ purded an izotopoù kinniget gant ar c'henderc'her. Implijit limma e R evit an dielfennadur eztaol diforc'hel. Ar roadennoù orin, disoc'hoù klask an diaz roadennoù, ha mont en-dro an dielfennañ roadennoù hag an disoc'hoù a vez enrollet en emglev ProteomeXchange dre ar sanailh kevredet PRIDE gant an anavezer strollad roadennoù PXD019690.
An notennoù fonksionel a binvidika an dielfennadur. Implijet e oa bet an ostilh Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) evit termeniñ pinvidigezh termenoù annotadur fonksionel ar strollad roadennoù da 8 sizhunvezh (Skeudenn 1). E berr gomzoù, ar roll proteinoù kementadel bet tapet diwar an dielfennadur roadennoù LC-MS/MS (spektrometriezh tolz tandem) a vez implijet gant ar c'hriterioù sil da-heul : Mus musculus a vez dibabet evel spesad ha foñs, hag ar rummad a ziskouez ar werzh P reizhet gant Benjamini evit pinvidikaat 0,05 pe izeloc'h a vez sellet outañ evel talvoudus. Evit ar grafik-mañ e vez diskouezet ar pemp rummad dreist uhelañ e pep strollad diazezet war ar werzh P kemmet. Gant an t-test lies, gant ar programm kreñvaat linennek div bazenn Benjamini, Krieger ha Yekutieli (Q = 5%), e vez graet un analizenn eztaol protein a-hed an amzer war ar c'hannaded pouezus anavezet e pep rummad, ha pep renk a vez dielfennet war-eeun. N'eus ket ezhomm da gemer un SD kempoell.
Evit keñveriañ disoc'hoù ar studiadenn-mañ gant diaz roadennoù embannet ha sevel un diagramm Venn e skeudenn 1, hon eus kendeuzet ar roll proteinoù kementadel gant notennoù MitoCarta 2.0 (24). Implijit an ostilh enlinenn Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) evit sevel an diagramm.
Evit gouzout hiroc'h diwar-benn an argerzhoù stadegel implijet evit an dielfennañ proteomek, kit da welet ar pennad a glot gant an dafar hag an doareoù. Evit an holl arnodoù all e c'haller kavout titouroù resis er vojenn a glot. Nemet pa vez spisaet un dra all, an holl roadennoù a vez eztaolet evel keitat ± SEM, hag an holl zielfennadurioù stadegel a zo bet graet gant ar meziant GraphPad Prism 8.1.2.
Evit kaout dafar ouzhpenn evit ar pennad-mañ, kit da welet http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ur pennad digor eo, skignet dindan termenoù an aotre-implijout Creative Commons Attribution-Non-Commercial, hag a aotre an implij, an dasparzh hag an adkempenn e forzh peseurt meziant, keit ha ma n'eo ket evit gounid armerzhel an implij diwezhañ ha ma'z eo reizh al labour orin. Dave.
Evezhiadenn : Goulenn a reomp diganeoc'h reiñ ho chomlec'h postel nemet evit ma ouezo an hini a ginnigit war ar bajenn e fell deoc'h e vefe gwelet ar postel gantañ ha n'eo ket spam. Ne vo ket tapet chomlec'h postel ebet ganeomp.
Implijet e vez ar goulenn-mañ evit gwiriañ hag-eñ oc'h ur weladenner ha mirout ouzh an enporzhiañ stroboù ent emgefre.
Gant E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
An analizoù proteomek eus an neuronoù direizh a ziskouezas e vez gweredekaet ar programmoù metabolek evit enebiñ ouzh an neurodistruj.
Gant E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
An analizoù proteomek eus an neuronoù direizh a ziskouezas e vez gweredekaet ar programmoù metabolek evit enebiñ ouzh an neurodistruj.
©2020 Kevredigezh Amerikan evit Araokaat ar Skiantoù. an holl wirioù miret. AAAS zo ur c'hevread eus HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ha COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.