Trugarez da vezañ deuet da weladenniñ Nature.com. Skoazell CSS bevennet en deus ar stumm merdeer oc'h arveret. Evit kaout an disoc'hoù gwellañ e kinnigomp deoc'h implijout ur stumm nevesoc'h eus ho merdeer (pe diweredekaat ar mod kempoell en Internet Explorer). E-keit-se, evit gwarantiñ ar skoazell dalc'hus, e tiskouezomp al lec'hienn hep stil na JavaScript.
Implijet e vez an asid propionek (PPA) evit studiañ perzh an direizhder mitokondriel e-barzh an direizhderioù neurodiorren evel an direizhder eus ar spektrum aotegezh. Anavezet eo ar PPA evit distrujañ biogenez, metabolism ha troc'h ar mitokondrioù. Koulskoude, efedoù ar PPA war dinamik ar mitokondrioù, ar rannadur hag ar c'hevreadur a chom diaes abalamour da natur amzerel kemplezh ar mekanikoù-se. Amañ e implijomp teknikoù skeudenniñ kementadel kemplezh evit studiañ penaos e vez efedus PPA war ultrastruktur, morfologiezh ha dinamik ar mitokondrioù e kelligoù SH-SY5Y heñvel ouzh an neuronoù. PPA (5 mM) a lakaas un digresk bras e gorread ar mitokondrioù (p < 0,01), treuzkiz ha tro-dro Feret (p < 0,05), hag e gorread 2 (p < 0,01). An analizenn lec'hiadur darvoudoù mitokondriek a ziskouezas ur c'hresk pouezus (p < 0,05) en darvoudoù rannañ ha kendeuziñ, o terc'hel evel-se kempouez ar rouedad mitokondriek dindan an amzer stress. Ouzhpenn-se e oa bet digresket kalz eztaol mRNA cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) hag OPA1 (p < 0,05). 01). Diskouez a ra kement-mañ adkempenn morfologiezh, biogenez ha dinamik ar mitokondrioù evit mirout o fonksion dindan an amzer stress. Ar roadennoù a ginnig ur sell nevez war efedoù ar PPA war dinamik ar mitokondrioù hag a laka war wel talvoudegezh an teknikoù skeudenniñ evit studiañ ar mekanikoù reoliañ kemplezh a zo e-barzh ar respontoù d'ar stress mitokondriel.
Perzhidi a-bouez eo ar mitokondrioù en ur bern arc'hwelioù kelligel en tu all d'o rolloù boas e produiñ energiezh ha biosintez. Ur reoler pennañ eo ar metabolism mitokondriek evit ar sinal kalsiom, an homeostaz metabolek ha redoks, ar sinal enflammus, ar c'hemmoù epigenetek, al lieskementadur kelligel, an diforc'hidigezh hag ar marv kelligel programmet1. Dreist-holl eo pouezus-kenañ ar metabolism mitokondriek evit diorren, bevañ ha mont en-dro an neuronoù hag e vez implijet kalz e meur a ziskouezadeg eus an neuropatologiezh2,3,4.
E-kerzh an dek vloaz tremenet eo deuet ar statud metabolek war wel evel ur reoler kreiz eus an neurogenez, an diforc'hidigezh, ar c'hrouiñ hag ar plastikelezh5,6. Nevez zo eo deuet morfologiezh ha dinamik ar mitokondrioù da vezañ elfennoù pouezus-kenañ eus ar mitoz, un argerzh dinamikel a zalc'h ur strollad mitokondrioù yac'h e-barzh ar c'helligoù. Reoliet e vez dinamik ar mitokondrioù gant hentoù etre-dizalc'h kemplezh a ya eus ar biogenez hag ar bioenergetik mitokondriel betek ar rannadur, ar c'hevreadur, an treuzdougen hag an diskar mitokondriek7,8. Distruj unan bennak eus ar mekanikoù enframmañ-se a laka da vezañ diaes kempenn ar rouedadoù mitokondriek yac'h hag en deus heuliadoù fonksionel pouezus evit an diorren neuro9,10. E gwirionez, e vez gwelet un direizhder eus dinamikoù ar mitokondrioù e meur a gleñved bred, neurodistrujus ha neurodiorren, en o zouez an gleñvedoù eus ar spektrum aotegezh (ASD)11,12.
Ur c'hleñved neurodiorren disheñvel eo an ASD gant ur savadur genetek hag epigenetek kemplezh. N'eus ket a var ebet war hêrezh an ASD, met n'eo ket bet komprenet mat c'hoazh an etiologiezh molekulel diazez. Dastum roadennoù diwar patromoù rakklinikel, studiadennoù klinikel ha roadennoù molekulel lies-omik a ginnig muioc'h-mui a brouennoù eus an direizhder mitokondriek en ASD13,14. Graet hon eus a-raok ur skramm metiladur an TDN dre ar genom en ur strollad klañvidi gant ASD hag anavezet hon eus genoù metilet disheñvel strollet a-hed hentoù metabol mitokondriek15. Da c'houde e voe embannet metiladur diforc'hel ar reolennoù kreiz eus biogenez ha dinamik ar mitokondrioù, a oa liammet gant kresk an niver a skouerennoù mtDNA hag ur c'hemm e profil metabolek an troazh en ASD16. Ar roadennoù a ginnig muioc'h-mui a brouennoù e c'hoari an emdroadur mitokondriel hag an homeostaz ur perzh kreiz e patofisiologiezh an ASD. Dre-se, gwellaat ar c'homprenadur mekanikel eus an darempred etre dinamikoù, morfologiezh ha fonksionoù ar mitokondrioù zo ur pal pennañ eus an enklaskoù a-hed an amzer war ar c'hleñvedoù neurologel a vez merket gant un direizhder mitokondriek eilrenk.
Implijet e vez alies teknikoù molekulel evit studiañ perzh ar genoù resis e respontoù d'ar stress mitokondriel. Koulskoude, an doare-se a c'hell bezañ bevennet gant natur liesdoare ha amzerel ar mekanikoù kontrollañ mitotek. Ouzhpenn-se, an eztaol diforc'hel eus ar genoù mitokondriek zo un diskouezer dieeun eus ar c'hemmoù fonksionel, dreist-holl pa vez dielfennet un niver bevennet a genoù hepken dre ret. Dre-se eo bet kinniget doareoù reizhoc'h evit studiañ arc'hwel ar mitokondrioù hag ar bioenergetik17. Tost-tre eo morfologiezh ar mitokondrioù ouzh dinamik ar mitokondrioù. Stumm, kevreadur ha framm ar mitokondrioù a zo pouezus-kenañ evit ar produiñ energiezh hag ar surentez mitokondriel ha kelligel5,18. Ouzhpenn-se e vez lakaet ar gaoz gant elfennoù liesseurt ar mitoz war ar c'hemmoù e morfologiezh ar mitokondrioù, ar pezh a c'hell servijout da boentoù talvoudus evit an direizhder mitokondriel ha reiñ un diazez evit studiadennoù mekanikel da heul.
Morfologiezh ar mitokondrioù a c'haller sellet war-eeun dre ar mikroskopiezh elektronek treuzkas (TEM), ar pezh a aotre da studiañ dre ar munud an ultrastruktur kelligel. TEM a wel war-eeun morfologiezh, stumm ha framm ar c'hristennoù mitokondriek e-keñver disoc'h ar mitokondrioù hiniennel, e-lec'h fiziañ hepken en treuzskrivadur genel, en eztaol protein pe er perzhioù fonksionel mitokondriel e poblañsoù kelligoù17,19,20. Ouzhpenn-se e aesa an TEM studiañ an etregweredoù etre ar mitokondrioù hag an organelloù all, evel ar rouedad endoplasmek hag an autofagozomoù, a c'hoari rolloù pennañ e fonksion ar mitokondrioù hag en homeostaz21,22. Setu perak eo TEM ur poent loc'hañ mat evit studiañ an direizhder mitokondriek a-raok lakaat ar gaoz war hentoù pe genoù resis. Dre ma teu ar fonksion mitokondriel da vezañ muioc'h-mui talvoudus evit an neuropatologiezh, ez eus ezhomm sklaer da vezañ gouest da studiañ war-eeun ha kementadel morfologiezh ha dinamik ar mitokondrioù e patromoù neuronel in vitro.
Er pennad-mañ e vez studiet emdroadur ar mitokondrioù en ur patrom neuronel eus an direizhder mitokondriel e-barzh an diwaskadenn eus ar spektrum aotegezh. A-raok hon eus embannet metiladur diforc'hel ar propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) en ASD15, un isunanenn eus an enzim propionyl-CoA carboxylase mitokondriek PCC. Anavezet eo e vez kaoz eus an direizhañ eus ar PCC evit dastum toksikel an deveradoù propionil, en o zouez an asid propionek (PPA)23,24,25. Diskouezet eo bet e vez torret ar metabolism neuronel gant ar PPA hag e cheñch ar c'homporterezh in vivo hag ur patrom loened diazezet eo evit studiañ ar mekanikoù neurodiorren a denn d'an ASD26,27,28. Ouzhpenn-se eo bet embannet e vez distrujet gant ar PPA galloud ar grogenn mitokondriel, ar biogenez hag an analañ in vitro hag implijet eo bet kalz evit modelañ an direizhder mitokondriel en neuronoù29,30. Koulskoude, n'eo ket bet komprenet mat c'hoazh efed an direizhder mitokondriel degaset gant ar PPA war morfologiezh ha dinamikadur ar mitokondrioù.
Ar studiadenn-mañ a implij teknikoù skeudenniñ kemplezh evit muzuliañ efedoù ar PPA war morfologiezh, dinamikadur ha fonksionoù ar mitokondrioù e kelligoù SH-SY5Y. Da gentañ, hon eus savet un doare TEM evit gwelet kemmoù e morfologiezh hag e ultrastruktur ar mitokondrioù17,31,32. Pa seller ouzh natur dinamek ar mitokondrioù33, hon eus implijet ivez an dielfennadur lec'hier darvoudoù mitokondriel (MEL) evit muzuliañ ar c'hemmoù er c'hempouez etre darvoudoù rannañ ha kendeuziñ, niver ha volum ar mitokondrioù dindan stress PPA. Erfin, hon eus studiet hag-eñ eo liammet morfologiezh ha dinamik ar mitokondrioù gant kemmoù en eztaol ar genoù a gemer perzh er biogenez, er rannadur hag er c'hevreadur. Kemeret asambles, hor roadennoù a ziskouez an diaesamant da zisplegañ kemplezhder ar mekanikoù a reol dinamik ar mitokondrioù. Lakaat a reomp war wel talvoudegezh an TEM evit studiañ morfologiezh ar mitokondri evel ur poent dibenn kenstag muzuliañ eus ar mitoz e kelligoù SH-SY5Y. Ouzhpenn-se e lakaomp war wel e kinnig ar roadennoù TEM an titouroù pinvidikañ pa vezont lakaet asambles gant teknikoù skeudenniñ a dap ivez darvoudoù dinamek e respont d'ar stress metabolek. Ur perzhded pelloc'h eus ar mekanikoù reoliañ molekulel a skoazell mitoz ar c'helligoù neuronel a c'hellfe reiñ ur sell pouezus war elfenn mitokondriek ar reizhiad nervel hag ar c'hleñvedoù neurodistrujus.
Evit lakaat ar stress mitokondriel da greskiñ e voe tretet ar c'helligoù SH-SY5Y gant PPA en ur implijout 3 mM ha 5 mM propionat sodiom (NaP). A-raok an TEM e oa bet lakaet ar skouerennoù da vezañ prientet dre ar skouerennoù kriogenek dre ar skornañ hag ar skornañ a wask uhel (Skeudenn 1a). Savet hon eus ur rouedad dielfennañ skeudennoù mitokondriel emgefreek evit muzuliañ eizh arventenn morfologel eus poblañsoù mitokondriel war teir eiladenn biologel. Kavet hon eus e oa bet cheñchet kalz pevar arventenn gant an tretañ PPA : gorread 2, gorread, troiad ha treuzkiz Feret (Skeudenn 1b–e). Digreskiñ a reas kalz an dachenn 2 gant an tretañ PPA 3 mM ha 5 mM (p = 0,0183 ha p = 0,002, hervez an urzh) (Skeudenn 1b), tra ma'z eo digresket kalz an dachenn (p = 0,003), ar c'horn-bro (p = 0,0106) hag an treuzkiz Feret. Ur c'hresk bras (p = 0,0172) a oa bet er strollad tretet 5 mM e-keñver ar strollad kontroll (Skeudenn 1c–e). Digreskoù pouezus e gorread ha tro-dro a ziskouezas e oa gant ar c'helligoù tretet gant 5 mM PPA mitokondrioù bihanoc'h ha rontoc'h, hag e oa ar mitokondrioù-se nebeutoc'h hir eget ar re a oa er c'helligoù kontroll. Heñvel eo ivez ouzh un digresk bras e treuzkiz Feret, ur perzh dizalc'h a ziskouez un digresk e pellder brasañ etre ribloù ar rannigoù. Gwelet e voe kemmoù en ultrastruktur ar c'hristennoù : ar c'hristennoù a zeuas da vezañ nebeutoc'h a-bouez dindan levezon ar stress PPA (Skeudenn 1a, panell B). Koulskoude, n'eo ket an holl skeudennoù a ziskoueze splann ultrastruktur ar c'hristennoù, setu n'eo ket bet graet un dielfennadur kementadel eus ar c'hemmoù-se. Ar roadennoù TEM-mañ a c'hell diskouez teir senario posupl : (1) ar PPA a greñva ar rannadur pe a harz ar c'hevreadur, o lakaat ar mitokondrioù zo anezho da zigreskiñ o ment ; (2) ar biogenez kreñvaet a grou mitokondrioù nevez ha bihanoc'h pe (3) a brodu an daou zoare war un dro. Daoust ma ne c'haller ket diforc'hañ an doareoù-se dre TEM, e tiskouez kemmoù morfologel pouezus kemmoù en homeostaz hag en dinamik mitokondriel dindan stress PPA. Goude-se hon eus ergerzhet perzhioù ouzhpenn evit termeniñ muioc'h an dinamikoù-se hag ar mekanikoù a c'hallfe bezañ diazez anezho.
An asid propionek (PPA) a adkempenn morfologiezh ar mitokondrioù. (a) Skeudennoù mikroskopiezh elektronek treuzkas (TEM) a ziskouez e tigresk ment ar mitokondrioù hag e teu ar mitokondrioù da vezañ bihanoc'h ha rontoc'h gant kresk an tretañ PPA ; 0 mM (hep tretañ), 3 mM ha 5 mM, hervez an urzh. Ar biroù ruz a ziskouez ar mitokondrioù. (b–e) Prientet e voe ar c'helligoù SH-SY5Y tretet gant PPA e-pad 24 eurvezh evit an TEM hag an disoc'hoù a voe dielfennet gant Fiji/ImageJ. Pevar eus an eizh arventenn a ziskouezas diforc'hioù pouezus etre ar c'helligoù kontroll (hep tretet, 0 mM PPA) hag ar c'helligoù tretet (3 mM ha 5 mM PPA). (b) Rannvro 2, (c) Gorread, (d) Troiad, (e) Treuzkiz ar Feret. An analizenn un tu eus ar varregezh (kontrol vs. tretañ) hag an test keñveriañ lies Dunnett a voe implijet evit termeniñ an diforc'hioù pouezus (p < 0,05). Ar poentoù roadennoù a zastum ar werzh mitokondriek keitat evit pep kellig hiniennel, hag ar barrennoù fazi a zastum ar geidenn ± SEM. Ar roadennoù diskouezet a zastum n = 3, 24 kellig dre eiladenn da nebeutañ ; en holl e oa bet dielfennet 266 skeudenn ; * a ziskouez p < 0,05, ** a ziskouez p < 0,01.
Evit termeniñ muioc'h penaos e respont dinamik ar mitokondrioù d'ar PPA, hon eus livet ar mitokondrioù gant ester etil tetrametilrodamin (TMRE) hag implijet ar mikroskopiezh dre amzer hag an dielfennadur MEL evit lec'hiañ ha muzuliañ ar mitokondrioù goude 24 eurvezh da 3 ha 5 mM PPA. Tretañ an darvoudoù rannañ ha kendeuziñ. (Skeudenn 2a). Goude an dielfennadur MEL e voe dielfennet muioc'h ar mitokondrioù evit muzuliañ an niver a frammoù mitokondriek hag o volum keitat. Gwelet hon eus ur c'hresk bihan met pouezus en niver a darvoudoù rannañ a c'hoarvez da 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] e-keñver rannañ [5,6 ± 0,3 (p < 0,05) )] ha kendeuziñ [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] ha kendeuziñ [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0.05)] <0.05)] a oa kresket kalz an darvoudoù da 5 mM e-keñver ar c'hontroll (Skeudenn 3b). Kresket eo kalz an niver a mitokondrioù e 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] ha 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Skeudenn 3c) , tra ma chome digemm volum keitat pep framm mitokondriel (Skeudenn 3c). 3d). Kemeret asambles, e talvez kement-mañ e talvez adkempenn dinamik ar mitokondrioù da respont digoll a zalc'h gant berzh gwirionded ar rouedad mitokondriel. Ar c'hresk en niver a darvoudoù rannañ da 3 mM PPA a ziskouez eo abalamour d'ar rannañ mitokondriel kresk an niver a mitokondrioù, met pa chom ar volum mitokondriel keitat hep cheñch, ne c'haller ket nac'hañ ar biogenez evel ur respont digoll ouzhpenn. Koulskoude, ar roadennoù-se a glot gant ar frammoù mitokondriel bihanoc'h ha ront a vez gwelet gant TEM ha diskouez a reont ivez kemmoù pouezus e dinamik ar mitokondrioù broudet gant PPA.
An asid propionek (PPA) a laka an adkempenn mitokondriek da vont en-dro evit mirout gwirionded ar rouedad. Sevenet e voe ar c'helligoù SH-SY5Y, tretet gant 3 ha 5 mM PPA e-pad 24 eurvezh ha livet gant TMRE ha Hoechst 33342 heuliet gant un dielfennadur MEL. (a) Skeudennoù mikroskopiezh time-lapse arouezius a ziskouez livioù ha rakweledennoù kreñvder uhelañ binarel d'an eur 2 (t2) evit pep stad. Rannvroioù dibabet diskouezet e pep skeudenn binarel a vez gwellaet ha diskouezet e 3D e teir prantad amzer disheñvel (t1-t3) evit skeudenniñ an emdroadur a-hed an amzer ; darvoudoù ar c'hevreadur a zo merket e gwer ; darvoudoù disrannañ a zo merket e gwer. Diskouezet e ruz. (b) Niver keitat a darvoudoù dinamek dre stad. (c) Niver keitat a frammoù mitokondriek dre gellig. (d) Volum keitat (µm3) pep framm mitokondriel dre gellig. Ar roadennoù diskouezet a ziskouez n = 15 kellig dre strollad tretañ. Ar barrennoù fazi diskouezet a zastum ar geidenn ± SEM, barrenn ar skalfad = 10 μm, * p < 0,05.
An asid propionek (PPA) a laka ar gened liammet ouzh dinamik ar mitokondrioù da vezañ mouget dre dreuzskrivañ. Tretet e voe ar c'helligoù SH-SY5Y gant 3 ha 5 mM PPA e-pad 24 eurvezh. Ar c'hantvedoù genetek keñverel a oa bet graet dre implijout RT-qPCR ha normalaet da B2M. Genoù biogenez ar mitokondrioù (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 ha (d) NFE2L2. Genoù kendeuzadur ha disrann mitokondriel (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 ha (i) DRP1. Diforc'hioù pouezus (p < 0,05) a oa bet amprouet dre implijout ANOVA un tu (kontrol vs. tretañ) ha test keñveriañ lies Dunnett : * a ziskouez p < 0,05, ** a ziskouez p < 0,01, ha **** a ziskouez p < 0,0001. Ar barrennoù a zastum an eztaol keitat ± SEM. Ar roadennoù diskouezet a zastum n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), ha n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) eiladenn biologel.
Roadennoù an analizoù TEM ha MEL a ziskouez asambles e cheñch ar PPA morfologiezh ha dinamik ar mitokondrioù. Koulskoude, an teknikoù skeudenniñ-se ne ginnigont ket ur sell war ar mekanikoù diazez a gas an argerzhioù-se war-raok. Neuze hon eus studiet eztaol mRNA nav reoler pennañ eus dinamik ar mitokondrioù, ar biogenez hag ar mitoz e respont d'an tretañ PPA. Muzuliañ a reomp an onkogen myeloma kelligel (cMYC), ar faktor analañ nukleel (NRF1), ar faktor treuzskrivañ mitokondriel 1 (TFAM), ar faktor treuzskrivañ heñvel ouzh NFE2 BZIP (NFE2L2), ar protein heñvel ouzh ar gastrin 2 (STOML2), an atrofiezh nervenn-sell 1 (OPA1 ), ar mitofuzin 1 (MFN1), ar Mitofusin (MFN12) ha Mitofusin (FN2) protein 1 liammet ouzh an dinamin (DRP1) goude 24 eurvezh tretañ gant 3 mM ha 5 mM PPA. Gwelet hon eus 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 ha p < 0,0001, hervez an urzh) ha 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) gant PPA. (Skeudenn 3a–c). An digresk en eztaol mRNA a oa diouzh ar c'hementad : an eztaol cMYC, NRF1 ha TFAM a zigreskas eus 5,7, 2,6 ha 1,9 gwech da 3 mM, hervez an urzh, ha da 11,2, 3 ha 2,2 gwech da 5 mM. Er c'hontrol, ne oa ket bet kemmet ar gen biogenez redoks kreiz NFE2L2 e kementad PPA ebet, daoust ma oa bet gwelet un tu heñvel diouzh an doare da zigreskiñ an eztaol (Skeudenn 3d).
Studiet hon eus ivez eztaol ar genoù klasel a gemer perzh e reoliañ ar rannadur hag ar c'hevreadur. Soñjal a reer e kemer perzh STOML2 er c'hevreadur, er mitofagiezh hag er biogenez, hag e eztaol a oa bet digresket kalz (p < 0,0001) gant 3 mM (2,4 gwech kemm) ha 5 mM (2,8 gwech kemm) PPA (Skeudenn 1). 3d). Heñvel, an eztaol genel OPA1 a oa digresket e 3 mM (1,6 gwech kemm) ha 5 mM (1,9 gwech kemm) PPA (p = 0,006 ha p = 0,0024, hervez an urzh) (Skeudenn 3f). Koulskoude, n'hon eus ket kavet diforc'hioù pouezus e-keñver eztaol ar genoù kendeuziñ MFN1, MFN2 pe ar genoù disrannañ DRP1 dindan stress PPA 24 eurvezh (Skeudenn 3g–i). Ouzhpenn-se hon eus kavet ne cheñche ket liveoù pevar proteinenn kendeuziñ ha disrannañ (OPA1, MFN1, MFN2 ha DRP1) dindan ar memes stadoù (Skeudenn 4a–d). Pouezus eo gouzout e tiskouez ar roadennoù-se ur mare hepken ha ne c'hellont ket diskouez kemmoù en eztaol protein pe liveoù obererezh e-pad mareoù kentañ ar stress PPA. Koulskoude, digreskoù pouezus en eztaol cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 hag OPA1 a ziskouez un direizhder treuzskrivañ pouezus eus ar metabolism, ar biogenez hag an dinamikoù mitokondriel. Ouzhpenn-se e laka ar roadennoù-se war wel talvoudegezh an teknikoù skeudenniñ evit studiañ war-eeun ar c'hemmoù stad dibenn e fonksion ar mitokondrioù.
N'eo ket bet cheñchet liveoù ar proteinoù faktor kendeuziñ ha rannañ goude an tretañ gant asid propionek (PPA). Tretet e voe ar c'helligoù SH-SY5Y gant 3 ha 5 mM PPA e-pad 24 eurvezh. Ar liveoù protein a oa bet muzuliet dre an analizenn Western blot, hag al liveoù eztaol a oa bet normalaet ouzh ar protein hollek. Diskouezet eo an eztaol protein keitat hag ar Western blotoù dileuriet eus ar protein tarzh hag eus ar protein hollek. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Ar barrennoù a zastum ar geidenn ± SEM, hag ar roadennoù diskouezet a zastum n = 3 eiladenn biologel. Keñverioù lies (p < 0,05) a oa bet graet dre implijout an analizenn unvan eus ar varregezh hag an test Dunnett. Ar gel hag ar blot orin a zo diskouezet e skeudenn S1.
An direizhder mitokondriel a zo liammet ouzh kleñvedoù liesreizhiad a ya eus ar c'hleñvedoù metabolek, kardiovaskulel ha kigennel betek ar c'hleñvedoù neurologel1,10. Kalz kleñvedoù neurodistrujus ha neurodistrujus a zo liammet ouzh an direizhder mitokondriel, ar pezh a laka war wel pouez an organelloù-se a-hed buhez an empenn. E-touez ar c'hleñvedoù-se e kaver kleñved Parkinson, kleñved Alzheimer hag ASD3,4,18. Koulskoude eo diaes mont e darempred gant gwiadoù an empenn evit studiañ ar c'hleñvedoù-se, dreist-holl war al live mekanikel, ar pezh a ra eus ar reizhiadoù patrom kelligel un doare all ret. Er studiadenn-mañ e implijomp ur reizhiad patrom kelligel o implijout kelligoù SH-SY5Y tretet gant PPA evit adkavout an direizhder mitokondriel a vez gwelet e kleñvedoù neuronel, dreist-holl e kleñvedoù ar spektrum aotegezh. Implijout ar patrom PPA-mañ evit studiañ emdroadur ar mitokondrioù en neuronoù a c'hellfe reiñ un tañva eus etiologiezh an ASD.
Ergerzhet hon eus ar c'halloud da implijout TEM evit gwelet ar c'hemmoù e morfologiezh ar mitokondrioù. Pouezus eo gouzout e rank TEM bezañ implijet evel m'eo dleet evit ma vo efedusoc'h. Prientiñ ar c'hrio-skouerennoù a aotre da virout gwelloc'h ar frammoù neuronel dre stagañ elfennoù kelligel war un dro ha dre zigreskiñ stummañ an artefaktoù34. Heñvel ouzh se, hon eus gwelet e oa gant kelligoù SH-SY5Y heñvel ouzh neuronoù organelloù iskellig en o fezh ha mitokondrioù hir (Skeudenn 1a). Gant-se e vez lakaet war wel talvoudegezh an teknikoù prientiñ kriogenek evit studiañ morfologiezh ar mitokondrioù e patromoù kelligoù neuronel. Daoust ma'z eo pouezus-kenañ ar muzulioù kementadel evit an dielfennadur gwirion eus roadennoù TEM, n'eus ket c'hoazh un emglev war peseurt arventennoù resis a ranker muzuliañ evit kadarnaat ar c'hemmoù morfologel mitokondriek. Diazezet war un niver bras a studiadennoù o deus studiet kementadel morfologiezh ar mitokondrioù17,31,32, hon eus savet ur rouedad dielfennañ skeudennoù mitokondriel emgefre a vuzul eizh arventenn morfologel, da lâret eo : gorread, gorread2, ment, troiad, kelc'hiad, derez, treuzkiz Feret. ha rontelezh.
En o zouez, PPA a zigreskas kalz an dachenn 2, an dachenn, ar c'horn-bro hag an treuzkiz Feret (Skeudenn 1b–e). Diskouezet en deus e oa deuet ar mitokondrioù da vezañ bihanoc'h ha rontoc'h, ar pezh a glot gant studiadennoù kent o tiskouez un digresk e gorread ar mitokondrioù goude 72 eurvezh stress mitokondriel degaset gant PPA30. Ar perzhioù morfologel-se a c'hellfe diskouez ur rannadur mitokondriel, un argerzh ret evit distagañ elfennoù gwallet diouzh ar rouedad mitokondriel evit brudañ o diskar dre ar mitofagiezh35,36,37. War un dro e c'hallfe an digresk e ment keitat ar mitokondrioù bezañ liammet ouzh ur biogenez kresket, ar pezh a gas da stummañ mitokondrioù bihan nevez-ganet. Ar rannañ pe ar biogenez kresket a dalvez ur respont digoll evit mirout ar mitoz a-enep ar stress mitokondriel. Koulskoude, ne c'haller ket dilezel ar c'hresk mitokondriek digresketoc'h, ar c'hevreadur gwan, pe stadoù all.
Daoust ma c'hall ar skeudennoù uhel-disoc'h krouet gant TEM termeniñ perzhioù morfologel war live ar mitokondrioù hiniennel, e vez produet gant an doare-se skeudennoù divvent en ur mare hepken. Evit studiañ ar respontoù dinamek d'ar stress metabolek hon eus livet ar mitokondrioù gant TMRE hag implijet ar mikroskopiezh time-lapse gant an dielfennadur MEL, ar pezh a aotre gwelet 3D uhel-treuzkas ar c'hemmoù er rouedad mitokondriel a-hed an amzer33,38. Gwelet hon eus kemmoù soutil met pouezus e dinamik ar mitokondrioù dindan stress PPA (Skeudenn 2). Da 3 mM e kreskas kalz an niver a darvoudoù rannañ, tra ma chome an darvoudoù kendeuziñ heñvel ouzh hini ar c'hontroll. Ur c'hresk en niver a darvoudoù rannañ ha kendeuziñ a voe gwelet e 5 mM PPA, met ar c'hemmoù-se a oa tost kenfeurel, ar pezh a laka da soñjal e tizh kinetikoù rannañ ha kendeuziñ an eilpennadur e kementadoù uheloc'h (Skeudenn 2b). Ar volum mitokondriek keitat a chomas hep cheñch e 3 ha 5 mM PPA, ar pezh a ziskouez e oa bet miret gwirionded ar rouedad mitokondriek (Skeudenn 2d). Diskouez a ra kement-se barregezh ar rouedadoù mitokondriek dinamek da respont d'ar stress metabolek skañv evit mirout an homeostaz en un doare efedus hep lakaat ar rouedadoù da vezañ rannet. Da 3 mM PPA eo a-walc'h ar c'hresk er rannañ evit brudañ an tremen d'un eilpennadur nevez, met ret eo adkempenn kinetek pounneroc'h evit respont d'ar stress degaset gant ar c'hementadoù uheloc'h a PPA.
Kreskiñ a reas an niver a mitokondrioù e-pad an daou gefluniadur stress PPA, met ne cheñchas ket kalz ar volum mitokondriel keitat (Skeudenn 2c). Marteze eo abalamour d'ur biogenez kresket pe d'ur rannadur kresket ; koulskoude, pa n'eus ket un digresk bras e volum keitat ar mitokondrioù, eo muioc'h a c'hoant da greskiñ ar biosintez. Koulskoude, ar roadennoù e skeudenn 2 a ziskouez ez eus daou argerzh digoll : ur c'hresk en niver a darvoudoù rannañ, kempoell gant reoliañ war-zu an uhelañ rannadur mitokondriel, hag ur c'hresk en niver a darvoudoù, kempoell gant biogenez ar mitokondrioù. A-benn ar fin, an digoll dinamek evit ar stress skañv a c'hell bezañ savet diwar argerzhioù war un dro a denn d'ar rannadur, d'ar c'hevreadur, d'ar biogenez ha d'ar mitofagiezh. Daoust ma'z eus bet diskouezet gant skrivagnerien kent e kresk ar mitoz30,39 hag ar mitofagiezh29 gant ar PPA, e kinnigomp testenioù evit adkempenn dinamikoù ar rannadur hag ar c'hevreadur mitokondriel e respont da PPA. Ar roadennoù-se a gadarna ar c'hemmoù morfologel bet gwelet gant an TEM hag a ginnig muioc'h a ditouroù diwar-benn ar mekanikoù liammet ouzh an direizhder mitokondriel degaset gant ar PPA.
Dre ma ne ginnige an analizenn TEM pe MEL testenioù reizh eus ar mekanikoù reoliañ genel a zo diazez ar c'hemmoù morfologel gwelet, hon eus studiet an eztaol ARN eus ar genoù a zo e-barzh ar metabolism, ar biogenez hag an dinamikoù mitokondriel. Ur faktor treuzskrivañ eo ar proto-onkogen cMYC hag a gemer perzh e reoliañ ar mitokondrioù, ar glikoliz, an asid amino hag ar metabolism asid druz40. Ouzhpenn-se, anavezet eo cMYC evit reoliañ eztaol tost 600 gen mitokondriel a gemer perzh en treuzskrivadur, en droidigezh hag en emvod kemplezh mitokondriek, en o zouez NRF1 ha TFAM41. NRF1 ha TFAM zo daou reolenner kreiz ar mitoz, o vont en-dro en a-us da PGC-1α evit gweredekaat an eiladenn mtDNA. An hent-se a vez gweredekaet gant ar sinaladur cAMP hag AMPK ha kizidik eo ouzh an dispignoù energiezh hag ouzh ar stress metabolek. Studiet hon eus ivez NFE2L2, ur reolenner redoks eus ar biogenez mitokondriel, evit gouzout hag-eñ e c'hallfe efedoù ar PPA bezañ etrebroadel gant ar stress oksidativel.
Daoust ma chome an eztaol NFE2L2 hep cheñch, hon eus kavet un digresk kempoell diouzh ar c'hementad en eztaol cMYC, NRF1 ha TFAM goude 24 eurvezh tretañ gant 3 mM ha 5 mM PPA (Skeudenn 3a–c). An digreskiñ eus an eztaol cMYC a zo bet danevellet a-raok evel ur respont d'ar stress mitokondriel42, hag er c'hontrol, an digreskiñ eus an eztaol cMYC a c'hell lakaat an direizhder mitokondriel da vont en-dro dre adkempenn ar metabolism mitokondriel, ar c'hennask rouedad hag ar polarizadur dre ar membranenn43. Dedennus eo, cMYC a gemer perzh ivez e reoliañ ar rannadur hag ar c'hevreadur mitokondriel42,43 hag anavezet eo evit kreskiñ fosforiladur DRP1 ha lec'hiadur ar mitokondrioù e-pad rannadur ar c'helligoù44, hag ivez evit mediañ an adkempenn morfologel mitokondriel e kelligoù-mamm neuronel45. E gwirionez, ar fibroblastoù hep cMYC a ziskouez ment mitokondriel digresketoc'h, ar pezh a glot gant ar c'hemmoù degaset gant ar stress PPA43. Ar roadennoù-se a ziskouez un darempred dedennus met n'eo ket sklaer c'hoazh etre cMYC ha dinamikoù ar mitokondrioù, ar pezh a ginnig ur pal dedennus evit studiadennoù da zont war an adkempenn degaset gant ar stress PPA.
Digreskiñ NRF1 ha TFAM a glot gant perzh cMYC evel un aktiver treuzskrivañ pouezus. Ar roadennoù-se a glot ivez gant studiadennoù kent war kelligoù krign-bev ar c'holonenn denel o tiskouez e oa bet digresket an eztaol mRNA NRF1 gant PPA e-pad 22 eurvezh, ar pezh a oa liammet gant diskar an ATP ha kresket ROS46. An aozerien-se o deus embannet ivez e oa kresket an eztaol TFAM da 8,5 eurvezh met distroet d'al liveoù diazez da 22 eurvezh. Er c'hontrol, Kim et al. (2019) a ziskouezas e oa digresket kalz an eztaol mRNA TFAM goude 4 eurvezh stress PPA e kelligoù SH-SY5Y ; koulskoude, goude 72 eurvezh, e oa kresket kalz an eztaol protein TFAM hag an niver a skouerennoù mtDNA a oa kresket kalz. Dre-se, an digresk en niver a genoù biogenez mitokondriek a weler goude 24 eurvezh ne zifenn ket ar c'hementad a c'hellfe bezañ liammet kresk an niver a mitokondrioù ouzh gweredekaat ar biogenez e mareoù kent. Studioù kent o deus diskouezet e vez kresket kalz an ARNm hag ar protein PGC-1α gant PPA e kelligoù SH-SY5Y da 4 eurvezh 30 munutenn, tra ma kresk an asid propionek ar biogenez mitokondriel en hepatosited ar c'halc'h dre PGC-1α da 12 eurvezh 39 munutenn. Dedennus eo, n'eo ket PGC-1α ur reoler treuzskrivañ reizh eus NRF1 ha TFAM hepken, met diskouezet eo bet ivez e reol obererezh MFN2 ha DRP1 dre reoliañ ar rannadur hag ar c'hevreadur47. Kemeret asambles, e laka war wel ar c'hevreadur strizh etre ar mekanikoù a reol ar respontoù digoll mitokondriek degaset gant ar PPA. Ouzhpenn-se e tiskouez hor roadennoù un disreoladur pouezus eus reoliñ treuzskrivañ ar biogenez hag ar metabolism dindan stress PPA.
Ar genoù STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 ha DRP1 a zo e-touez ar reolennerien greiz eus ar rannadur, ar c'hevreadur hag an dinamikoù mitokondriel37,48,49. Meur a gen all a zo e-barzh dinamik ar mitokondrioù, koulskoude, STOML2, OPA1 ha MFN2 a zo bet kavet a-raok e oant bet metilet en un doare disheñvel e-barzh ar c'hohortoù ASD,16 ha meur a studiadenn dizalc'h o deus embannet kemmoù er faktoroù treuzskrivañ-se e respont d'ar stress mitokondriel50,51. 52. An eztaol eus OPA1 ha STOML2 a oa bet digresket kalz gant 3 mM ha 5 mM PPA tretañ (Skeudenn 3e, f). OPA1 zo unan eus ar reolennoù klasel eus ar c'hevreadur mitokondriel dre etregweredoù reizh gant MFN1 ha 2 hag a c'hoari ur roll en adkempenn ar c'hristennoù hag er morfologiezh mitokondriel53. N'eo ket sklaer c'hoazh perzh resis STOML2 e dinamik ar mitokondrioù, met diskouez a ra an testenioù e c'hoari ur roll e kendeuzadur ar mitokondrioù, ar biogenez hag ar mitofagiezh.
STOML2 a gemer perzh e mirout ar c'hevreadur analañ mitokondriek ha stummañ kemplezhoù chadenn analañ54,55 ha diskouezet eo bet e cheñch kalz perzhioù metabolek ar c'helligoù kankr56. Studioù o deus diskouezet e vez broudet ar galloud hag ar biogenez gant STOML2 dre etregwered gant BAN ha kardiolipin 55, 57, 58. Ouzhpenn-se, studiadennoù dizalc'h o deus diskouezet e vez reoliet ar mitofagiezh gant an etregwered etre STOML2 ha PINK159,60. Da skouer, STOML2 a zo bet embannet e kejañ war-eeun gant ha stabilaat MFN2 hag e c'hoari ivez ur roll pouezus e stabilaat izoformoù hir OPA1 dre stankañ ar proteaz karget eus diskar OPA153,61,62. An digresk en eztaol STOML2 a vez gwelet e reaktadennoù PPA a c'hellfe lakaat ar proteinoù-se da vezañ muioc'h kizidik ouzh an diskar dre hentoù diouzh an ubiquitin hag ar proteasom48. Daoust ma n'eo ket sklaer perzh resis STOML2 hag OPA1 er respont dinamek d'ar PPA, e c'hallfe an eztaol digreskiñ eus ar genoù kendeuziñ-se (Skeudenn 3) distrujañ ar c'hempouez etre ar rannañ hag ar kendeuziñ ha kas da zigreskiñ ment ar mitokondrioù (Skeudenn 3). 1).
War un dro, ez eo chomet hep cheñch an eztaol protein OPA1 goude 24 eurvezh, tra ma ne cheñch ket kalz liveoù mRNA ha protein MFN1, MFN2 pe DRP1 goude an tretañ gant PPA (Skeudenn 3g-i, Skeudenn 4). Gallout a rafe diskouez n'eus kemm ebet e reoliadurezh ar faktoroù-se a zo e-barzh ar c'hevreadur hag ar rannadur mitokondriek. Koulskoude, ret eo gouzout e vez reoliet pep hini eus ar pevar gen-se ivez gant kemmoù goude-treuzskrivañ (PTM) a reol obererezh ar proteinoù. OPA1 en deus eizh stumm splice all a vez rannet proteolitek er mitokondrioù evit produiñ daou izoform disheñvel 63 . Ar c'hempouez etre an izoformoù hir ha berr a ziviz a-benn ar fin perzh OPA1 e kendeuziñ ar mitokondrioù hag e kempenn ar rouedad mitokondriek64. Reoliet eo obererezh DRP1 gant fosforiladur ar protein kinaz II (CaMKII) diouzh ar c'halsiom/kalmodulin, tra ma vez reoliet diskar DRP1 gant an ubikitinadur hag an SUMOiladur65. Erfin, DRP1 ha MFN1/2 a zo GTPaseoù, setu e c'hall an obererezh bezañ levezonet gant feur produiñ GTP er mitokondrioù 66 . Dre-se, daoust ma chom eztaol ar proteinoù-se digemm, ne c'hellfe ket diskouez obererezh pe lec'hiadur ar proteinoù digemm67,68. E gwirionez, ar repertorioù protein PTM zo anezho a servij alies da linenn difenn gentañ karget da genderc'hel gant ar respontoù stress akut. Pa vez ur stress metabolek etre en hor patrom, eo posupl e vez broudet gant PTM obererezh kresket ar proteinoù fusion ha fission evit adtapout a-walc'h integritezh ar mitokondrioù hep bezañ ezhomm da lakaat ar genoù-se da vont en-dro ouzhpenn war live an ARNm pe ar protein.
Kemeret asambles, ar roadennoù meneget a-us a laka war wel ar reoliñ kemplezh ha diouzh an amzer eus morfologiezh ar mitokondrioù hag an diaesterioù da zisplegañ ar mekanikoù-se. Evit studiañ an eztaol genetek eo ret da gentañ anavezout genoù tarzh resis en hent. Koulskoude, hor roadennoù a ziskouez ne respont ket ar genoù er memes hent er memes doare d'ar memes stress. E gwirionez, studiadennoù kent o deus diskouezet e c'hall genoù disheñvel er memes hent diskouez profiloù respontoù amzerel disheñvel30,46. Ouzhpenn-se ez eus mekanikoù post-treuzskrivañ kemplezh a zistruj an darempred etre an treuzskrivañ hag arc'hwel ar genoù. Ar studiadennoù proteomek a c'hell reiñ titouroù diwar-benn efedoù ar PTMoù hag ar fonksionoù protein, met lakaat a reont ivez diaesterioù, en o zouez doareoù treuzdougen izel, feur sinal-trouz uhel ha diskoulmoù fall.
Er c'henarroud-se, studiañ morfologiezh ar mitokondrioù dre implijout TEM ha MEL a c'hallfe respont da c'houlennoù diazez diwar-benn an darempred etre dinamikoù ha fonksionoù ar mitokondrioù ha penaos e levezon ar c'hleñvedoù. Ar pouezusañ eo ma kinnig an TEM un doare reizh da vuzuliañ morfologiezh ar mitokondrioù evel ur poent dibenn kenstag eus an direizhder hag an dinamikoù mitokondriel51. MEL a ginnig ivez un doare reizh da welet darvoudoù rannañ ha kendeuziñ en un endro kelligel teirdimensionel, ar pezh a aotre da gementañ an adkempenn mitokondriel dinamek zoken pa ne vez ket kemmoù en eztaol genel33. Amañ e lakaomp war wel talvoudegezh an teknikoù skeudenniñ mitokondriek e kleñvedoù mitokondriel eilrenk. Ar c'hleñvedoù-se a vez merket dre ret gant ur stress metabolek dous kronikel, aroueziet gant un adkempenn soutil eus ar rouedadoù mitokondriek kentoc'h eget gant un distruj mitokondriek a-vremañ. Koulskoude, ar c'hempouez mitokondriel ret evit mirout ar mitoz dindan stress kronikel en deus heuliadoù fonksionel pouezus. E-barzh an neuroskiantoù e c'hallfe ur gwelloc'h kompren eus ar mekanikoù digoll-se reiñ titouroù pouezus diwar-benn an neuropatologiezh pleiotropek liammet ouzh an direizhder mitokondriek.
A-benn ar fin e laka hor roadennoù war wel talvoudegezh an teknikoù skeudenniñ evit kompren heuliadoù fonksionel an etregweredoù kemplezh etre an eztaol genel, ar c'hemmoù protein hag an obererezh protein a reol dinamikoù ar mitokondrioù neuronel. Implijet hon eus PPA evit modelañ an direizhder mitokondriel en ur patrom kelligoù neuronel evit kaout ur sell war elfenn mitokondriel an ASD. Ar c'helligoù SH-SY5Y tretet gant PPA a ziskouezas kemmoù e morfologiezh ar mitokondrioù : ar mitokondrioù a zeuas da vezañ bihan ha ront, ha fall e oa ar c'hristennoù pa oant bet sellet outo gant TEM. An analizenn MEL a ziskouez e c'hoarvez ar c'hemmoù-se war un dro gant ur c'hresk en darvoudoù rannañ ha kendeuziñ evit mirout ar rouedad mitokondriel e respont d'ur stress metabolek skañv. Ouzhpenn-se, PPA a zistruj kalz reoliadur treuzskrivañ ar metabolism hag an homeostaz mitokondriel. Anavezout a reomp cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 hag OPA1 evel reolierien mitokondriel pennañ distrujet gant stress PPA ha gallout a reont c'hoari ur roll e-barzh ar c'hemmoù degaset gant PPA e morfologiezh ha fonksionoù ar mitokondrioù. Ezhomm zo eus studiadennoù da zont evit termeniñ gwelloc'h ar c'hemmoù amzerel degaset gant ar PPA en eztaol genel hag en obererezh protein, al lec'hiadur hag ar c'hemmoù goude an treuzfurmadur. Gant hor roadennoù e vez lakaet war wel kemplezhder hag etre-dizalc'hiezh ar mekanikoù reoliañ a gas da respont d'ar stress mitokondriel ha diskouez a reont talvoudegezh an TEM hag an teknikoù skeudenniñ all evit studiadennoù mekanik muioc'h a-fet tarzh.
Prenet e oa bet al linenn gellig SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) digant Sigma-Aldrich. Kresket e voe ar c'helligoù SH-SY5Y e meskaj boued Eagle kemmet/F-12 (DMEM/F-12) ha L-glutamine (SC09411, ScienCell) e-barzh flaskoù 25 cm2 ouzhpennet gant 20% a serum bovin fetal (FBS) (1943, 1936) ha skiant-faltazi 1% penisilin-streptomisin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) da 37 °C, 5% CO2. Issevenaet e voe ar c'helligoù betek 80% a glot gant 0,05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), sentrifuget da 300 g ha pladet gant ur stankter a war-dro 7 × 105 kellig/ml. An holl arnodoù a oa bet kaset da benn war kelligoù SH-SY5Y nann-diforc'h etre ar pennadoù 19–22. PPA a vez roet evel NaP. Dizoloiñ poultr NaP (CAS No. 137-40-6, formulenn gimiek C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) en dour tomm MilliQ betek ur c'hementad a 1 M ha mirout anezhañ da 4 °C. D'an deiz tretañ, diluzit an disoc'h-se gant 1 M PPA da 3 mM ha 5 mM PPA en ur metoù hep serum (DMEM/F-12 gant L-glutamin). Ar c'hementadoù tretañ evit an holl arnodoù a oa PPA ebet (0 mM, kontroll), 3 mM, ha 5 mM PPA. Graet e oa bet an arnodoù e teir adlavarenn biologel da nebeutañ.
Hadet e voe ar c'helligoù SH-SY5Y e flaskoù 25 cm5 gant ur feur a 5,5 × 105 kellig/ml ha kresket e voent e-pad 24 eurvezh. Ouzhpennet e voe an tretañ PPA d'ar flask a-raok 24 eurvezh enkubadur. Dastum pelletoù kelligoù en ur heuliañ ar c'homenadoù issevenadur gwiadoù bronneged normal (deskrivet a-us). Adlakaat ar c'helligoù e 100 μl glutaraldehid 2,5%, 1× PBS ha mirout da 4 °C betek ma vo treuzfurmet. Kreizennet e voe ar c'helligoù SH-SY5Y evit ur pennadig evit lakaat ar c'helligoù da vezañ pellet ha tennañ 2,5% glutaraldehid, disoc'h 1× PBS. Adlakaat ar gouelez en ur gel agarozenn 4% prientet en dour strilhañ (1:1 eo ar c'heñver agarozenn ouzh volum ar gouelez). Lakaet e voe tammoù agarozenn war grizilh war bladennoù plaen ha goloet gant 1-heksadesen a-raok o skornañ dindan gwask uhel. Skornet e voe ar skouerennoù en aseton sec'h 100% da -90°C e-pad 24 eurvezh. Goude-se e voe savet an temperadur da -80°C hag ouzhpennet e voe un disoc'h 1% tetroksid osmiom ha 0,1% glutaraldehid. Miret e voe ar skouerennoù da -80°C e-pad 24 eurvezh. Goude-se e voe kresket an temperadur tamm-ha-tamm betek temperadur ar gambr e-pad meur a zevezh : eus – 80 °C da – 50 °C e-pad 24 eurvezh, da – 30 °C e-pad 24 eurvezh, da – 10 °C e-pad 24 eurvezh hag a-benn ar fin betek temperadur ar gambr. gwrez.
Goude ar prientiñ kriogenek e voe enframmet ar skouerennoù gant rezin ha graet e voe tammoù tredan (∼100 nm) gant un ultramikrotom Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Livet e voe ar rannoù gant 2% asetat uranil ha sitrat plom. Ar skouerennoù a oa bet sellet outo gant ur mikroskop elektronek treuzkas FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (FEI gwechall), Eindhoven, an Izelvroioù) o vont en-dro da 200 kV (skigner Lab6) hag ur c'hamera CCD Gatan (Gatan, Rouantelezh-Unanet) staliet gant ur sil energiezh Tridiem.
E pep eiladenn deknikel e oa bet tapet 24 skeudenn kellig unvan da nebeutañ, evit 266 skeudenn en holl. An holl skeudennoù a oa bet dielfennet dre implijout ar makro Rannvro Dedenn (ROI) hag ar makro Mitokondri. Diazezet eo ar makro mitokondriek war an doareoù embannet17,31,32 hag a aotre an treuzfurmadur hanter-emgefre eus skeudennoù TEM e Fiji/ImageJ69. E berr gomzoù : ar skeudenn a zo troet ha troet dre implijout un diverkañ foñs gant ur vell roudennek (60 piksel radius) hag ur sil tremen-bandenn FFT (o implijout bevennoù uhelañ hag izelañ 60 ha 8 piksel hervez) ha mougañ al linennoù a-serzh gant un doujañs tuadur a 5%. Ar skeudenn treuzfurmet a vez termenet ent emgefre dre implijout un algoritm entropiezh uhelañ hag ur maskl binarel a vez krouet. Rannvroioù skeudennoù liammet ouzh ROIoù dibabet dre zorn e skeudennoù TEM c'hrouet a voe tennet, o termeniñ ar mitokondrioù hag o lemel ar grogenn plasma hag ar rannvroioù all gant ur c'hontrast uhel. Evit pep ROI tennet e voe dielfennet rannigoù binarel brasoc'h eget 600 piksel, ha muzuliet e voe gorread ar rannigoù, ar perimetr, an aheloù bras ha bihan, treuzkiz Feret, rontded ha kelc'hiad dre implijout arc'hwelioù muzuliañ enkorfet Fiji/ImageJ. Da-heul Merrill, Flippo, ha Strack (2017) e oa bet jedet ar gorread 2, ar c'heñver rannigoù (keñver ahel bras ha bihan), hag ar faktor stumm (FF) diwar ar roadennoù-se, ma oa FF = perimetr 2/4pi x gorread. Kavout a reer termenadur ar formulenn parametrikel e Merrill, Flippo, ha Strack (2017). Ar makroioù meneget a c'haller kaout war GitHub (gwelet Disklêriadur war ar roadennoù). E keitat e oa bet dielfennet war-dro 5 600 rannig dre dretadenn PPA, evit un hollad a war-dro 17 000 rannig (roadennoù na vezont ket diskouezet).
Lakaet e voe ar c'helligoù SH-SH5Y e pladoù sevenadur 8 kambr (ThermoFisher, #155411) evit ma c'hallfent bezañ stag e-pad an noz ha goude-se e voent enkubet gant TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) ha Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, #15411). livañ. Skeudennoù a oa bet tennet dre implijout laseroù 405 nm ha 561 nm war un endro 10 munutenn, ha skeudennoù c'hrouet a oa bet tennet evel z-stacks enno 10 mikrograf skeudenn gant pazenn az a 0,2 μm etre frammoù skeudenn e 12 poent amzer da-heul. Dastumet e oa bet ar skeudennoù gant ur bladenn Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 super-resolution (Carl Zeiss, Oberkochen, Alamagn) gant ur LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Skeudennoù a oa bet dielfennet en ImageJ dre implijout ur pipeline deskrivet a-raok hag an enlugellad ImageJ evit muzuliañ darvoudoù kendeuzadur ha rannadur, niver keitat ar frammoù mitokondriel, ha volum keitat mitokondriel dre gellig33. Kavout a reer ar makroioù MEL war GitHub (gwelet an Disklêriadur diwar-benn ar roadennoù).
Kresket e voe ar c'helligoù SH-SY5Y e pladennoù c'hwec'h poull gant ur stankter a 0,3 × 106 kellig/mL e-pad 24 eurvezh a-raok an tretañ. Tennañ a reer an ARN dre ar c'homenad Quick-RNATM Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) gant kemmoù bihan : ouzhpennañ 300 μl a tampon liziñ ARN da bep poull a-raok tennañ ha lizañ pep skouerenn evel pazenn ziwezhañ gant 30 μl a eluiñ DNase/RNase. -dour digoust. An holl skouerennoù a oa bet gwiriet evit ar c'hantved hag ar c'halite dre implijout ur spektrofotometr NanoDrop ND-1000 UV-Vis. Protein hollek al lizadoù kelligoù a oa bet tapet dre implijout 200 μl tampenn lise RIPA, ha muzuliet e oa bet ar c'honsentradur protein dre implijout an analizenn protein Bradford70.
Graet e oa bet ar sintezenn cDNA gant ar TetroTM cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) hervez titouroù ar c'henderc'her gant kemmoù zo. Sintezet e oa bet an ADNc e reaktadennoù 20 μl en ur implijout 0,7 da 1 μg a ARN hollek. Dibabet e oa bet ar primeroù diwar pennadoù embannet a-raok 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Taolenn S1) ha savet e oa bet ar sontennoù a-gevret gant an ostilh PrimerQuest eus Integrated DNA Technologies. An holl genoù a bouez a oa bet normalaet d'ar gen B2M nukleel. Muzuliañ a reer an eztaol genetek STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC hag OPA1 dre RT-qPCR. Er meskaj mestr e oa ar polimeraz LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 μM a primeroù war-raok hag en-dro, cDNA, ha dour a live PCR evit kaout ur volum diwezhañ a 10 μL evit pep reaktadenn. Muzuliañ a reer eztaol ar genoù rannañ ha rannañ (DRP1, MFN1/2) dre implijout arnodennoù liespleg TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) a oa bet implijet hervez titouroù ar c'henderc'her gant kemmoù bihan. Ar meskaj mestr RT-qPCR liesdoare a zo ennañ 1X LUNA Taq polimeraz, 10 μM primeroù war-raok ha war-gil, 10 μM sontenn, cDNA, ha dour a live PCR, ar pezh a zegas ur volum diwezhañ a 20 μL evit pep reaktadur. RT-qPCR a oa bet graet gant Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—niverenn heuliad : R0618110). Diskouezet eo an doareoù marc'h-houarn e taolenn S1. An holl skouerennoù cDNA a voe amplifiet e teir gwech hag ur c'hrommenn skoueriek a voe krouet dre implijout un heuliad diluzioù dek gwech. Tennet e oa bet eus an dielfennadur an elfennoù diavaez e skouerennoù teirglok gant un diforc'h standart (Ct) >0,5 evit gwarantiñ adproduiñ ar roadennoù30,72. An eztaol genetek keñverel a oa bet jedet dre implijout an doare 2-ΔΔCt79.
Skouerioù protein (60 μg) a voe mesket gant un tamm kargañ Laemmli en ur feur 2:1 ha kaset da benn war ur gel protein divliv 12% (Bio-Rad #1610184). Treuzkaset e voe ar proteinennoù d'ur grogenn PVDF (fluorid poliviniliden) (#170-84156, Bio-Rad) dre implijout ar reizhiad Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Stanket e voe ar grogenn ha goret gant an enepkorfoù kentañ dereat (OPA1, MFN1, MFN2, ha DRP1) (diluet 1:1000) e-pad 48 eurvezh, ha goude-se goret gant enepkorfoù eilrenk (1:10 000) e-pad 1 eurvezh. Neuze e voe skeudennaouet ar membranennoù gant Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) hag enrollet gant ur reizhiad Bio-Rad ChemiDoc MP. ImageLab stumm 6.1 a oa bet implijet evit an analizañ Western blot. Ar gel hag ar blot orin a zo diskouezet e skeudenn S1. Titouroù diwar-benn an enepkorfoù a zo kinniget e taolenn S2.
Kinniget e vez an ensavadurioù roadennoù evel ar geidenn hag ar fazi skoueriek eus ar geidenn (SEM) eus teir skouerenn dizalc'h da nebeutañ. An ensavadurioù roadennoù a oa bet amprouet evit o normalelezh dre implijout an test Shapiro-Wilks (nemet ma vefe meneget un dra all) a-raok kemer e kont un dasparzh gaussian hag un diforc'h standart heñvel ha mont pelloc'h gant an dielfennadurioù. Ouzhpenn dielfennañ ar roadennoù dre implijout LSD MEL Fisher (p < 0,05), ANOVA un tu (keidenn tretañ ouzh kontroll), ha test keñveriañ lies Dunnett evit termeniñ ar ster (p < 0,05). Ar gwerzhioù p pouezus a zo diskouezet er grafik evel *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. An holl zielfennadurioù stadegel hag ar grafikoù a oa bet graet ha krouet gant GraphPad Prism 9.4.0.
Ar makroioù Fiji/ImageJ evit an dielfennañ skeudennoù TEM a c'haller kaout war GitHub : https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Ar makro Mitochondrial Event Locator (MEL) a c'haller kaout war GitHub : https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM ha Vijaya A. Mitokondrioù : reolierien mestr ar metabolism, an homeostaz, ar stress, ar gozhni hag an epigenetik. Indonezeg. Skiantoù ar vevoniezh. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Disfonksion mitokondriek liesdoare er skizofreniezh, kemplezh I evel tarzh patologel posupl. Skizofreniezh. danvez. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. ha Beal, MF Disfonksion ar mitokondrioù e kleñved Parkinson. J. Neurokimiezh. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG ha Mehta V. Mitokondrioù stresset : palioù an aloubadeg e kleñved Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF ha Ferreira GK Mitokondrioù hag an empenn : bioenergetik ha muioc'h c'hoazh. Neurotoksinoù. danvez. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. hag all. Mitokondrioù pleiotropek : levezon ar mitokondrioù war diorren an neuronoù hag ar c'hleñvedoù. J. Neuroskiantoù. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. ha Morais, VA Biogenez ar mitokondrioù en neuronoù : penaos ha pelec'h. etrebroadel. J. Mohr. ar skiant. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. ha Zhao, J. Reoliañ emdroadur mitokondriel ar bronneged : digarezioù ha diaesterioù. tal. endokrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. ha Slack, RS Dinamikoù ar mitokondrioù e reoliñ an neurogenez : eus an empenn o tiorren d'an empenn oadour. diorren. dinamek. 247, 47–53 (2018).