Ul lodenn eus an danvez enklask “Gwellaat resistañs al legumaj ouzh ar patogenoù hag ar plaenennoù” eo ar pennad, gwelet an holl 5 pennad
Ar c'hleñved kaoz eus nekroz ar plant fongek Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary a implij ur strategiezh lieslive evit gloazañ plant degemerer disheñvel. Kinnig a ra ar studiadenn-mañ implijout an diamin L-ornitin, un asid amino nann-protein hag a vroud sintezenn asidoù aminek diazez all, evel ur strategiezh merañ all evit gwellaat respontoù molekulel, fiziologel ha biokimiek Phaseolus vulgaris L. d'ar moul gwenn degaset gant Pseudomonascleromonas. Arnodoù in vitro o deus diskouezet e oa bet harzet kalz kresk miseliel S. pyrenoidosa gant L-ornitin en un doare diouzh ar c'hementad. Ouzhpenn-se e c'hallfe digreskiñ kalz pouez ar moul gwenn e-barzh an tiez-gwer. Ouzhpenn-se e voe broudet kresk ar plant tretet gant an L-ornitin, ar pezh a ziskouez ne oa ket fitotoksikel ar c'hementadoù L-ornitin amprouet evit ar plant tretet. Ouzhpenn-se, L-ornitin a greskas eztaol an enepoksidantoù nann-enzimatek (fenolikoù ha flavonoidoù dizoloet en holl) hag an enepoksidantoù enzimek (katalaz (CAT), peroksidaz (POX) ha polifenol oksidaz (PPO)), hag a greskas eztaol tri gen liammet ouzh an enepoksidant (PSO1, PVGRAT, ha PVGRAT). Ouzhpenn-se, an analizenn in silico a ziskouezas bezañs ur protein oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) e genom S. sclerotiorum, a oa heñvel-tre ouzh proteinoù oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) ha Penicillium sp. (PlOAH) evit a sell ouzh an dielfennadur fonksionel, an domanioù miret hag an topologiezh. Dedennus eo, ouzhpennañ L-ornitin d'ar metoù bouilhenn dekstroz patatez (PDB) a zigreskas kalz eztaol ar gen SsOAH e miseliom S. sclerotiorum. Heñvel, implij diavaez L-ornitin a zigreskas kalz eztaol ar gen SsOAH e miselioù ar funged dastumet diwar plant tretet. Erfin, implij L-ornitin a zigreskas kalz ar sekredur trenkenn oksalek e-barzh ar meziant PDB hag ar delioù klañv. Evit echuiñ, L-ornithine a c'hoari ur perzh pennañ evit mirout ar statud redoks hag ivez evit gwellaat respont difenn ar plant klañv. Disoc'hoù ar studiadenn-mañ a c'hellfe sikour da sevel doareoù nevezus ha doujus d'an endro evit kontrollañ ar moull gwenn ha digreskiñ e efedoù war ar produiñ fav hag ar plant all.
Ar moul gwenn, degaset gant ar fungus nekrotrofek Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, zo ur c'hleñved spontus, a zigresk ar gounezerezh, hag a zo ur gwallzarvoud bras evit ar produiñ fav (Phaseolus vulgaris L.) dre vras ​​(Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum zo unan eus ar patogenoù plant fongek diaesañ da reoliñ, gant ur rummad degemer ledan a ouzhpenn 600 spesad plant hag ar galloud da maserañ buan gwiadoù an degemer en un doare dibar (Liang ha Rollins, 2018). E-barzh an amzerioù dic'hortoz e tremen ur prantad kriz eus e gelc'hiad buhez, o chom kousket e-pad pell evel frammoù du, kalet, heñvel ouzh had anvet 'sclerotia' en douar pe evel kresk gwenn ha moan e-barzh miseliom pe e-kreiz ar plant klañv (Schwartz et al., 2005). Gouest eo S. sclerotiorum da stummañ sklerotioù, ar pezh a ro tro dezhañ da vevañ e-pad pell amzer e tachennoù klañv ha da genderc'hel e-pad ar c'hleñved (Schwartz et al., 2005). Pinvidik eo ar sklerotioù e boued, gallout a reont chom en douar e-pad pell, ha servijout a reont da inokulum pennañ evit ar c'hleñvedoù da heul (Schwartz et al., 2005). E-barzh an amzer a-feson e c'hwezh ar sklerotioù hag e produont sporennoù en aer a c'hell gloazañ an holl lodennoù a-us d'an douar eus ar plant, en o zouez bleunioù, skourroù pe podoù (Schwartz et al., 2005).
Implijout a ra Sclerotinia sclerotiorum ur strategiezh lieslive evit gloazañ e blantennoù degemerer, enni un heuliad darvoudoù kenurzhiet adalek ar c'hrouiñ sklerotiel betek diorren ar sintomoù. Da gentañ e produ S. sclerotiorum sporennoù stag (anvet askosporoù) diwar frammoù heñvel ouzh ar c'hebell-touseg anvet apothecia, a zeu da vezañ en aer hag a zeu da vezañ sklerotioù nann-mobil war lastez plant klañv (Bolton et al., 2006). Neuze e vez skarzhet asid oksalek gant ar fungus, ur faktor virulent, evit kontrolliñ pH pared kelligoù ar plant, broudañ an diskar enzimek hag aloubadeg ar gwiadoù (Hegedus ha Rimmer, 2005), ha mougañ tarzh oksidativel ar plant ostiz. An argerzh asidifikadur-se a wana ar pared kelligoù plant, o kinnig un endro dereat evit obererezh normal hag efedus an enzimoù a zistruj ar pared kelligel fongek (CWDEoù), ar pezh a ro tro d'ar patogen da drec'hiñ ar barrenn fizikel ha da dreuziñ ar gwiadoù degemerer (Marciano et al., 1983). Ur wech treuzet e vez skarzhet un toullad CWDEoù gant S. sclerotiorum, evel ar poligalaktoronaz hag ar c'helluloz, ar pezh a aesa e skignañ er gwiadoù klañv hag a laka nekroz ar gwiadoù. Mont war-raok al lezioù hag ar steuñvoù hifal a gas da arouezioù arouezius ar moul gwenn (Hegedus ha Rimmer, 2005). E-keit-se e anavez ar plant degemerer patromoù molekulel liammet ouzh ar patogenoù (PAMPoù) dre ar reseverien anavezout patromoù (PRRoù), o lakaat da dalvezout un heuliad darvoudoù sinañ a laka ar respontoù difenn da vont en-dro a-benn ar fin.
Daoust da dekvloaziadoù a strivoù evit kontrolliñ ar c'hleñvedoù, e chom mankoù germplasm resis a-walc'h er fav, evel e plant kenwerzhel all, abalamour da nerzh, da vevañ ha da emdroadur ar patogen. Diaes-tre eo merañ ar c'hleñvedoù neuze ha ret eo kaout ur strategiezh kevredet ha liesdoare a endalc'h ur meskaj etre ar pratikoù sevenadurel, ar c'hontrol biologel hag ar fongisidoù kimiek (O'Sullivan et al., 2021). Ar c'hontrol kimiek eus ar moul gwenn eo an hini efedusañ rak ar fongizidoù, pa vezont implijet evel m'eo dleet hag er mare dereat, a c'hell kontrolliñ skignañ ar c'hleñved en un doare efedus, digreskiñ grevusded ar c'hleñved ha digreskiñ ar c'holloù produiñ. Koulskoude, an implij dreistordinal hag ar fiziañs dreistordinal war ar fongizidoù a c'hell lakaat war wel spesadoù resis eus S. sclerotiorum ha lakaat un efed negativel war an organegoù nann-tarzh, yec'hed an douar ha kalite an dour (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Dre-se eo deuet da vezañ ur pal pennañ kavout doareoù all a-du gant an endro.
Ar poliaminoù (PA), evel ar putressin, ar spermidin, ar spermin hag ar c'hadaverin, a c'hell bezañ doareoù all prometet a-enep ar patogenoù plant a vez kaset dre an douar, ha dre-se e vez digresket penn-da-benn pe evit ul lodenn implij ar fongizidoù kimiek dañjerus (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Er plant uheloc'h e kemer perzh ar PAoù e meur a argerzh fiziologel, en o zouez, met hep bezañ bevennet da, rannadur ar c'helligoù, diforc'hidigezh, ha respont d'ar stressoù abiotek ha biotek (Killiny ha Nehela, 2020). Gallout a reont ober evel enepoksidantoù, sikour da zistrujañ ar spesadoù oksigen reaktivel (ROS), mirout an homeostaz redoks (Nehela ha Killiny, 2023), broudañ genoù liammet ouzh an difenn (Romero et al., 2018), reoliañ hentoù metabolek liesseurt (Nehela ha Killiny, 2023), modulañ an enhorfioù hag enhorgenoù (Nehela ha Killiny, 2023) Killiny, 2019), staliañ ar resistañs sistemek (SAR), ha reoliañ an etregweredoù plant-patogen (Nehela ha Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Ret eo merkañ e cheñch ar mekanikoù hag ar rolloù resis a zo gant ar PAoù e difenn ar plant diouzh ar spesadoù plant, ar patogenoù hag an endro. Ar PA stankañ er plant a vez biosintezet diwar ar poliamin L-ornitin diazez (Killiny ha Nehela, 2020).
Meur a roll a c'hoari an L-ornitin e kresk ha diorren ar plant. Da skouer, studiadennoù kent o deus diskouezet e c'hallfe an ornitin bezañ liammet gant adkempenn an nitrogen (Liu et al., 2018), ar produadur riz, ar c'halite hag ar c'hwezh (Lu et al., 2020), hag ar respont d'ar stress dour (Yang et al., 2000). Ouzhpenn-se, an implij diavaez eus L-ornitin a greskas kalz gouzañv ar sec'hor e-barzh ar beterabez-sukr (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) hag a zigreskas ar stress holen en ognon (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu ha Çavuşoǧlu, 2021) hag ar plant cashena (Accidale) Rocha et al., 2012). Ar perzh a c'hallfe kaout an L-ornitin en difenn ouzh ar stress abiotek a c'hell bezañ abalamour d'e gemer perzh e dastum ar prolin e plant tretet. Da skouer, ar genoù liammet ouzh metabolegezh ar prolin, evel ar genoù ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) ha proline dehydrogenase (ProDH1 ha ProDH2), a zo bet embannet a-raok e oant e-barzh difenn Nicotiana benthamiana hag Arabidopsis thaliana a-enep ar spesadoù Pseudomonas nann-ostiz (Kumare, ha Mysoil 2012). War un dro, ezhomm zo eus an ornitin dekarboksilaz (ODC) fongek evit kreskiñ ar patogenoù (Singh et al., 2020). Tarzhañ ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici dre ar silensadur genetek broudet gant an ostiz (HIGS) a greskas kalz resistañs ar plant tomatez ouzh ar Fusarium wilt (Singh et al., 2020). Koulskoude, n'eo ket bet studiet mat ar perzh a c'hallfe bezañ gant implij an ornitin diavaez a-enep ar stressoù biotek evel ar fitopatogenoù. Pouezusoc'h c'hoazh, efedoù an ornitin war ar resistañs ouzh ar c'hleñvedoù hag ar fenomenoù biokimiek ha fiziologel stag outo a chom dizoloet dre vras.
Kompren kemplezhded ar c'hleñved S. sclerotiorum war al legumaj a zo pouezus evit sevel strategiezhioù kontrollañ efedus. Er studiadenn-mañ hon eus klasket anavezout perzh a c'hallfe bezañ an diamin L-ornitin evel un elfenn bennañ evit gwellaat mekanikoù difenn ha resistañs ar plant legumaj ouzh ar c'hleñved Sclerotinia sclerotiorum. Soñjal a reomp e c'hoari an L-ornitin ur perzh pennañ ivez evit mirout ar statud redoks, ouzhpenn kreñvaat respontoù difenn ar plant klañv. Kinnig a reomp e vefe liammet efedoù posubl L-ornitin ouzh reoliañ ar mekanikoù difenn enepoksidant enzimek ha nann-enzimatek hag ouzh an emdroadur gant faktoroù patogeniezh/virulens ar foue hag ar proteinoù stag outo. An arc'hwelioù div wech-se eus an L-ornithine a ra anezhañ un danvez prometet evit ur strategiezh padus evit digreskiñ efed ar moul gwenn ha kreñvaat resistañs ar plant legumaj boutin ouzh ar patogen fongek kreñv-se. Disoc'hoù ar studiadenn-mañ a c'hellfe sikour da sevel doareoù nevezus ha doujus d'an endro evit kontrolliñ ar moull wenn ha digreskiñ e efedoù war ar produiñ legumaj.
Er studiadenn-mañ e oa bet implijet ur seurt fav boutin kenwerzhel kizidik, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), evel dafar arnodiñ. Hadoù yac'h a oa bet pourvezet gant madelezh gant Departamant Enklask al Legumaj, Ensavadur Enklask ar Labour-douar (FCRI), Kreizenn Enklask al Labour-douar (ARC), Egipt. Pemp had a oa bet hadet e podoù plastik (treuzkiz diabarzh 35 cm, donder 50 cm) leuniet gant douar gloazet gant S. sclerotiorum e-barzh an ti-gwer (25 ± 2 °C, glebor keñverel 75 ± 1%, 8 eurvezh gouloù/16 eurvezh teñval). 7-10 devezh goude an hadañ (DPS) e voe stanket ar plant evit lezel daou blankenn hepken gant ur c'hresk unvan ha teir delioù astennet penn-da-benn e pep pod. Douraet e veze an holl blantennoù e podoù ur wech bep div sizhunvezh ha feurmet bep miz d'ar feur erbedet evit ar spesad roet.
Evit prientiñ ur c'hementad 500 mg/L a L-ornithinediamine (anvet ivez asid (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alamagn), e voe teuzet 50 mg da gentañ e 100 mL dour distilhet steril. Goude-se e voe diluet an disoc'h stok hag implijet en arnodoù da-heul. E berr gomzoù, c'hwec'h heuliad a gementadoù L-ornitin (12,5, 25, 50, 75, 100, ha 125 mg/L) a voe amprouet in vitro. Ouzhpenn-se e oa bet implijet dour distilhet steril evel kontroll negativel (Mock) hag implijet e oa bet evel kontroll pozitivel ar fongizid kenwerzhel “Rizolex-T” 50% poultr gleb (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia, Gouarnour Egy). Ar fongisid kenwerzhel “Rizolex-T” a oa bet amprouet in vitro e pemp feur (2, 4, 6, 8 ha 10 mg/L).
Dastumet e oa bet skouerennoù eus skourroù ha podoù fav boutin o tiskouez sintomoù stank ar moull wenn (feur enkadenn : 10–30%) eus feurmoù kenwerzhel. Daoust ma oa bet anavezet an darn vrasañ eus an dafar plant klañv dre spesad/seurt (seurt kenwerzhel kizidik Giza 3), lod all, dreist-holl ar re bet tapet war ar marc'hadoù lec'hel, a oa spesadoù dianav. An dafar kontammet dastumet a voe dilouzet da gentañ gant un dizoloadenn 0,5% a hipoklorit sodiom e-pad 3 munutenn, goude-se e voent gwalc'het meur a wech gant dour distilhet steril ha sec'het gant paper-sil steril evit tennañ an dour dreist. Neuze e voe troc'het an organoù klañv e tammoù bihan eus ar gwiad kreiz (etre ar gwiadoù yac'h hag ar re gloazet), sevenet war ur meziant agar dekstroz patatez (PDA) ha goret da 25 ± 2 °C gant ur c'helc'hiad 12 eurvezh gouloù/12 eurvezh teñvalijenn e-pad 5 devezh evit broudañ stummadur ar sklerotioù. Implijet e oa bet ivez an doare beg miseliel evit glanaat digenvezoù fongek diwar sevenadurioù mesket pe saotret. Anavezout a reer da gentañ an digenvez fongek puraet diwar e berzhioù morfologel sevenadurel ha goude-se e voe kadarnaet e oa S. sclerotiorum diwar e berzhioù mikroskopek. Erfin, an holl izeladurioù puraet a voe amprouet evit o patogeniezh war ar seurt fav boutin Giza 3 evit klotañ gant postuladoù Koch.
Ouzhpenn-se e oa bet kadarnaet an digenvez S. sclerotiorum ar muiañ en em ledañ (digenvez #3) diwar heuliañ an etrefas treuzskrivet diabarzh (ITS) evel deskrivet gant White et al., 1990 ; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. E berr gomzoù, an digenvezed a oa bet sevenet e soubenn dekstroz patatez (PDB) hag enkubet da 25 ± 2 °C e-pad 5–7 devezh. Dastumet e voe neuze ar miseliom fongek, silet dre ur vantell keuz, gwalc'het div wech gant dour steril, ha sec'het gant paper-sil steril. Dizoloet e oa bet an TDN genomek dre implijout ar Quick-DNATM Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Neuze e voe kreñvaet rannvro rDNA ITS dre implijout ar c'houblad primeroù spesadel ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; ment gortozet : 540 pb) ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). Kaset e voe ar produioù PCR puraet evit an heuliañ (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Ar rummadoù rDNA ITS a oa bet heuliet en div du dre implijout an doare heuliañ Sanger. Neuze e voe keñveriet an heuliadoù goulennoù bodet gant ar roadennoù diwezhañ e GenBank hag er National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) dre implijout ar meziant BLASTn. Keñveriet e oa bet an heuliad goulenn gant 20 spesad/digenvez S. sclerotiorum all bet adtapet diwar ar roadennoù diwezhañ e NCBI GenBank (Taolenn ouzhpenn S1) en ur implijout ClustalW er Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; stumm 11) (Kumar et al., 2024). Graet e oa bet an analizenn emdroadur dre implijout an doare probabilitez uhelañ hag ar patrom erlec'hiañ nukleotidoù amzerel dre vras ​​(Nei ha Kumar, 2000). Diskouezet eo ar wezenn gant ar log-likelihood uhelañ. Dibabet eo ar wezenn gentañ evit an enklask heuristikel dre zibab ar wezenn gant ar log-likelihood uheloc'h etre ar wezenn neighbor-joining (NJ) (Kumar et al., 2024) hag ar wezenn parsimoniezh uhelañ (MP). Savet e oa bet ar wezenn NJ dre implijout ur matris pellder daou-ha-daou jedet dre implijout ar patrom hollek a c'haller distreiñ d'an amzer (Nei ha Kumar, 2000).
Obererezh enepbakteriel L-ornitin hag ar bakterilazh “Rizolex-T” a oa bet termenet in vitro dre an doare skignañ agar. Hent : Kemer ar c'hementad dereat eus an disoc'h L-ornitin (500 mg/L) ha meskañ anezhañ mat gant 10 ml eus ar metoù boued PDA evit prientiñ disoc'hoù gant ar c'hementadoù diwezhañ a 12,5, 25, 50, 75, 100 ha 125 mg/L, hervez an urzh. Pemp kresk eus ar fongisid “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 ha 10 mg/L) ha dour distilhet steril a voe implijet evel kontroll. Goude ma oa bet kalet ar metou, e oa bet treuzkaset ur plug miseliom nevez-prientet eus ar sevenadur Sclerotinia sclerotiorum, 4 mm e dreuzkiz, da greiz ar plad Petri ha sevenet da 25±2°C betek ma voe goloet ar plad Petri kontroll a-bezh gant ar miseliom, ha goude-se e voe enrollet kresk ar funged. Jediñ ar c'hantved a harz ouzh kresk skinel S. sclerotiorum dre implijout ar gevatalenn 1 :
Adgraet e voe an arnod div wech, gant c'hwec'h eiladenn biologel evit pep strollad kontroll/arnodiñ ha pemp pod (daou blantenn dre pod) evit pep eiladenn biologel. Pep eiladenn biologel a oa bet dielfennet div wech (daou eiladenn deknikel) evit gwarantiñ reizhder, fiziañs ha reizhded an disoc'hoù arnodiñ. Ouzhpenn-se e oa bet implijet an dielfennadur probit evit jediñ ar c'honsentradur harz hanter-uhelañ (IC50) hag IC99 (Prentice, 1976).
Evit priziañ barregezh an L-ornitin e-barzh an ti-gwer e oa bet kaset da benn daou arnod pod war-lerc'h. E berr gomzoù, leuniet e voe ar podoù gant douar pri-traezh sterilizet (3:1) hag inokulaet gant ur sevenadur nevez-prientet eus S. sclerotiorum. Da gentañ, an digenvez en em ledañ eus S. sclerotiorum (digenvez #3) a oa bet sevenet dre droc'hañ ur sklerotiom e daou, e lakaat e zremm war ur PDA hag e enkubañ da 25°C en deñvalijenn bepred (24 eurvezh) e-pad 4 devezh evit stimulañ kresk ar miseliom. Neuze e voe kemeret pevar bouchon agar 5 mm treuzkiz eus ar bord a-raok hag inokulaet gant 100 g eus ur meskaj steril a ed ha bran riz (1:1, v/v) hag an holl flaskoù a voe goret da 25 ± 2 °C dindan ur c'helc'hiad 12 eurvezh gouloù/12 eurvezh teñvalijenn e-pad 5 devezh evit stimulañ ar c'hrouiñ sclerotia. Mesket mat e oa bet endalc'had an holl flaskoù evit ma vefe heñvel a-raok ouzhpennañ douar. Neuze e voe ouzhpennet 100 g eus ar meskaj bran trevadenniñ da bep pod evit ma vefe ur c'hementad patogenoù digemm. Douraet e voe ar podoù enlakaet evit lakaat ar fungi da greskiñ ha lakaet e voent e-barzh un ti-gwer e-pad 7 devezh.
Pemp had eus ar spesad Giza 3 a voe hadet neuze e pep pod. Evit ar podoù tretet gant L-ornitin hag ar fongisid Rizolex-T e voe soubet ar hadoù sterilizet da gentañ e-pad daou eurvezh en un disoc'h dourek eus an daou genaozad gant ur c'hementad IC99 diwezhañ a war-dro 250 mg/L ha 50 mg/L, hervez an urzh, ha goude-se e voe sec'het en aer e-pad un eurvezh a-raok hadañ. War un dro e oa bet soubañ ar hadoù en dour distilhet steril evel kontroll negativel. Goude 10 devezh, a-raok an dourañ kentañ, e voe stanket ar plant, o lezel daou blantenn reizh hepken e pep pod. Ouzhpenn-se, evit gwarantiñ an infeksion gant S. sclerotiorum, e voe troc'het skourroù plant fav er memes pazenn diorren (10 devezh) e div lec'h disheñvel gant ur skalpel sterilizaet ha lakaet e voe war-dro 0,5 g eus ar meskaj bran trevadenniñ e pep gouli, heuliet gant ur glebor uhel evit stimulañ an holl blantennoù kontammet ha kontammet. Gloazet e voe ar plant kontroll en un doare heñvel ha lakaet e voe ur c'hementad heñvel (0,5 g) a meskaj bran steril ha hep trevadenniñ er gouli ha miret dindan ur glebor uhel evit simulañ an endro evit diorren ar c'hleñvedoù ha gwarantiñ ar c'henderc'hañ etre ar strolladoù tretañ.
Doare tretañ : Douraet e voe ar plant fav gant 500 ml a zisoc'h dourek L-ornitin (250 mg/l) pe ar fongisid Rizolex-T (50 mg/l) dre dourañ an douar, ha goude-se e voe adgraet an tretañ teir gwech etre 10 devezh. Douraet e voe ar c'hontrolloù tretet gant plasebo gant 500 ml dour distilhet steril. An holl dresadennoù a oa bet kaset da benn e-barzh an ti-gwer (25 ± 2°C, 75 ± 1% a glebor keñverel, hag ur prantad luc'hskeudenn 8 eurvezh gouloù/16 eurvezh teñval). Douraet e veze an holl podoù bep daou viz ha tretet bep miz gant un engravadur NPK kempoell (20-20-20, gant 3,6% a soufr ha mikroelfennoù TE; Zain Seeds, Egipt) gant ur c'hementad a 3–4 g/l dre spurmantiñ war delioù hervez ar c'hemennadennoù evit ar spesad resis ha titouroù ar c'henderc'her. Ma ne vefe ket meneget un dra all, e oa bet dastumet delioù darev ledanaet penn-da-benn (2vet ha 3vet delioù eus an nec'h) diwar pep eiladenn biologel 72 eurvezh goude an tretañ (hpt), homogenizet, strollet ha miret da -80 °C evit dielfennadurioù all, en o zouez, met hep bezañ bevennet da, lec'hiadur histokimiek in situ an diskouezadegoù stress oksidativel, an diskoulmoù peroksidantel hag an enzimet enepoksidantoù nann-enzimatek hag eztaol genel.
Priziet e veze kreñvder ar c'hleñved-red gwenn bep sizhun 21 devezh goude an inokuladur (dpi) dre implijout ur skalfad 1–9 (Taolenn ouzhpenn S2) diazezet war ar skalfad Petzoldt ha Dickson (1996) kemmet gant Teran et al. (2006). E berr gomzoù, ar skourroù hag ar skourroù eus ar plant fav a voe studiet o kregiñ gant ar poent enlakaat evit heuliañ mont war-raok al lezioù a-hed an etrenodoù hag an nodennoù. Muzuliañ a reer neuze pellder al lamm eus al lec'h ma oa bet enlakaet betek al lec'h pellañ a-hed ar skourr pe ar brank ha roet e voe ur skor a 1–9 diouzh lec'hiadur al lamm, ma tiskoueze (1) ne oa ket bet gwelet ur c'hleñved e-kichen al lec'h ma oa bet enlakaet ha (2–9) e oa bet kresket tamm-ha-tamm ment al lamm hag e vont war-raok a-hed an nodennoù etre nodennoù (Taolenn S2 S2). Neuze e oa bet amdroet nerzh ar c'hleñved-red gwenn e dregantad dre implijout ar formulenn 2 :
Ouzhpenn-se e oa bet jedet an dachenn dindan ar c'hrommenn araokaat ar c'hleñved (AUDPC) dre implijout ar formulenn (Shaner ha Finney, 1977), a oa bet azasaet nevez zo evit ar c'hrouadur gwenn eus ar fav boutin (Chauhan et al., 2020) dre implijout an daveenn 3 :
Lec'h ma Yi = grevusded ar c'hleñved d'ar mare ti, Yi+1 = grevusded ar c'hleñved d'ar mare da zont ti+1, ti = mare ar muzuliañ kentañ (e deizioù), ti+1 = mare ar muzuliañ da heul (e deizioù), n = niver hollek ar poentoù amzer pe ar poentoù evezhiañ. Arventennoù kresk ar plant fav, en o zouez uhelder ar plant (cm), an niver a skourroù dre blantenn, hag an niver a delioù dre blantenn a voe enrollet bep sizhun e-pad 21 devezh en holl eiladennoù biologel.
E pep eiladenn biologel e oa bet dastumet skouerennoù delioù (an eil hag an trede delioù diorroet penn-da-benn eus an nec'h) d'ar 45vet devezh goude an tretañ (15 devezh goude an tretañ diwezhañ). Pep eiladenn biologel a oa ennañ pemp pod (daou blantenn dre pod). War-dro 500 mg eus ar gwiad flastret a voe implijet evit tennañ livioù fotosintetek (klorofil a, klorofil b ha karotenoidoù) en ur implijout 80% aseton da 4 °C en deñvalijenn. Goude 24 eurvezh e voe greizennet ar skouerennoù ha dastumet e voe ar surnatant evit termeniñ ar c'hlorofil a, ar c'hlorofil b hag ar c'harotenoidoù dre livioù dre implijout ur spektrofotometr UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan) hervez an doare (Lichtenthaler, 1987) da vuzuliañ ar gwagennoù hirder disheñvel (A470, A646 hag A663 nm). Erfin, e oa bet jedet endalc'had ar pigmantoù fotosintetek dre implijout ar formulennoù 4–6 da-heul deskrivet gant Lichtenthaler (1987).
Da 72 eurvezh goude an tretañ (hpt), e voe dastumet delioù (eil ha trede delioù diorroet penn-da-benn eus an nec'h) eus pep eiladenn biologel evit lec'hiadur histokimiek in situ ar peroksid hidrogen (H2O2) hag an anion superoksid (O2•−). Pep eiladenn biologel a oa ennañ pemp pod (daou blantenn dre pod). Pep eiladenn biologel a oa bet dielfennet e div eiladenn (daou eiladenn deknikel) evit gwarantiñ reizhder, fiziañs ha reizhded an doare. H2O2 hag O2•− a oa bet termenet dre implijout 0,1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alamagn) pe nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alamagn), hervez an doareoù deskrivet gant Romero-Puertas et al. (2004) hag Adam et al. (1989) gant kemmoù bihan. Evit lec'hiadur histokimiek H2O2 in situ e voe enframmet ar follennoù dre goullo gant 0,1% DAB e 10 mM tampon Tris (pH 7,8) ha goude-se e voe goret e temperadur ar gambr er gouloù e-pad 60 munutenn. Gwennaet e voe ar follennoù e 0,15% (v/v) TCA e 4:1 (v/v) etanol:kloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) ha goude-se e voent lakaet dirak ar gouloù betek ma teñvalaent. Heñvel, ar valvoù a oa bet enframmet dre vakuum gant 10 mM tampon fosfat potasiom (pH 7,8) ennañ 0,1 w/v % HBT evit lec'hiadur histokimiek O2•− in situ. Goret e voe ar follennoù er gouloù e temperadur ar gambr e-pad 20 munutenn, goude-se e voent gwennaet evel a-us, ha goude-se e voent sklêrijennet betek ma teufe war wel tachennoù glas teñval/violet. Priziet e oa bet nerzh al liv gell (evel diskouezer H2O2) pe glas-violet (evel diskouezer O2•−) dre implijout stumm Fiji ar pakad tretañ skeudennoù ImageJ (http://fiji.sc; bet gwelet d'ar 7 a viz Meurzh 2024).
Termenet e oa bet ar malondialdehid (MDA; evel merker peroksidadur al lipidoù) hervez doare Du ha Bramlage (1992) gant kemmoù bihan. Dastumet e voe delioù pep eiladenn biologel (an eil hag an trede delioù diorroet penn-da-benn eus an nec'h) 72 eurvezh goude an tretañ (hpt). Pep eiladenn biologel a endalc'he pemp pod (daou blantenn dre pod). Pep eiladenn biologel a oa bet dielfennet e div eiladenn (daou eiladenn deknikel) evit gwarantiñ reizhder, fiziañs ha reizhded an doare. E berr gomzoù, 0,5 g a gwiad delioù malet a oa bet implijet evit tennañ MDA gant 20% a asid trikloroasetek (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, SUA) ennañ 0,01% a hidroksitoluen butilet (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). An endalc'had MDA er surnatant a voe termenet dre liv dre vuzuliañ an absorbañs da 532 ha 600 nm gant ur spektrofotometr UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan) ha goude-se e voe eztaolet evel nmol g−1 FW.
Evit priziañ an enepoksidantoù nann-enzimatek hag enzimek e voe dastumet delioù (an eil hag an trede delioù diorroet penn-da-benn eus an nec'h) eus pep eiladenn biologel 72 eurvezh goude an tretañ (hpt). Pep eiladenn biologel a oa ennañ pemp pod (daou blantenn dre pod). Pep skouerenn biologel a oa bet dielfennet e div skouerenn (daou skouerenn deknikel). Daou delioù a voe malet gant nitrogen liñvel hag implijet war-eeun evit termeniñ an enepoksidantoù enzimek ha nann-enzimatek, an aminoasidoù hollek, an endalc'had prolin, an eztaol genel hag ar c'hementad oksalat.
Termenet e oa bet ar fenolioù dizoloet hollek dre implijout ar reagent Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) gant kemmoù bihan en doare deskrivet gant Kahkonen et al. (1999). E berr gomzoù, war-dro 0,1 g a gwiad delioù homogenezet a voe tennet gant 20 ml metanol 80% en deñvalijenn e-pad 24 eurvezh ha dastumet e voe ar surnatant goude ar greizennañ. 0,1 ml eus an tennadenn skouerenn a voe mesket gant 0,5 ml a reagent Folin-Ciocalteu (10%), hejet e-pad 30 s ha lezet en deñvalijenn e-pad 5 munutenn. Neuze e voe ouzhpennet 0,5 ml a zisoc'h karbonat sodiom 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egipt) da bep tubenn, mesket mat ha goret e temperadur ar gambr en deñvalijenn e-pad 1 eurvezh. Goude an enkubadur e voe muzuliet absorbañs ar meskaj reaktadur da 765 nm gant ur spektrofotometr UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan). Termenet e oa bet ar c'hementad fenoloù dizoloet hollek en tennadennoù skouerennoù dre implijout ur c'hrommenn kalibrañ asid galek (Fisher Scientific, Hampton, NH, SUA) hag eztaolet evel miligrammoù a asid galek kevatal dre gram pouez fresk (mg GAE g-1 pouez fresk).
Termenet eo bet an endalc'had flavonoidoù dizoloet hollek hervez doare Djeridane et al. (2006) gant kemmoù bihan. E berr gomzoù, 0,3 ml eus an eztennañ metanol meneget a-us a voe mesket gant 0,3 ml a zisoc'h klorid aluminiom 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, SUA), mesket start ha goude-se e voe goret e temperadur ar gambr e-pad 5 munutenn, heuliet gant ouzhpennadur 0,3 ml a zisoc'h potasiom 00% asiat. (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), mesket mat ha goret e temperadur ar gambr e-pad 30 munutenn en deñvalijenn. Goude an enkubadur e voe muzuliet absorbañs ar meskaj reaktadur da 430 nm gant ur spektrofotometr UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan). Termenet e oa bet ar c'honsentradur flavonoidoù dizoloet hollek en tennadoù skouerennoù dre implijout ur c'hrommenn kalibrañ rutin (TCI America, Portland, OR, SUA) ha goude-se e oa bet eztaolet evel miligrammoù kevatal rutin dre gramm pouez fresk (mg RE g-1 pouez fresk).
Termenet eo bet hollad an asid amino frank e delioù ar fav dre implijout ur reagent ninhidrin kemmet (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SUA) diazezet war an doare kinniget gant Yokoyama ha Hiramatsu (2003) ha kemmet gant Sun et al. (2006). E berr gomzoù, 0,1 g a gwiad douar a voe tennet gant un tampon pH 5,4, ha 200 μL eus ar surnatant a voe reaktet gant 200 μL a ninhidrin (2%) ha 200 μL a piridin (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, SUA), enkubet en dour berv e-pad ur banell 30 min ha goude-se e voe yenaet da 580 nm gant ur spektrofotometr UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan). War un dro e oa bet termenet ar prolin dre an doare Bates (Bates et al., 1973). Tennet e voe ar prolin gant 3% asid sulfosalicylic (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SUA) ha goude ar greizennañ e voe mesket 0,5 ml eus ar surnatant gant 1 ml asid asetek skornek (Fisher Scientific, Hampton, NH, SUA) ha reagent ninhidrin, enkubet da 90°C, ha koolet e-pad muzuliet da 520 nm gant ar memes spektrofotometr hag a-us. An holl asidoù amino frank hag ar prolin en tennadoù delioù a oa bet termenet dre implijout krommennoù kalibrañ glisin ha prolin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SUA), hervez an urzh, hag eztaolet evel mg/g pouez fresk.
Evit termeniñ obererezh enzimek an enzimoù enepoksidant e voe tennet war-dro 500 mg a gwiad homogenezet gant 3 ml a tampon Tris 50 mM (pH 7,8) ennañ 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) ha 7,5% polipirolidon (PH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA), greizennet da 10 000 × g e-pad 20 munutenn dindan yenaat (4 °C), ha dastumet e voe ar surnatant (tennañ enzim kriz) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Neuze e voe reaktet ar c'hatalaz (CAT) gant 2 ml a 0,1 M a tampon fosfat sodiom (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) ha 100 μl a zisoc'h H2O2 269 mM evit termeniñ hec'h obererezh enzimek hervez doare Aebi (1984) gant kemmoù slight-Nagar (Nagar et al. 2023; Osman et al., 2023). Termenet e oa bet obererezh enzimek ar peroksidaz diouzh ar guaiacol (POX) dre implijout doare Harrach et al. (2009). (2008) gant kemmoù bihan (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) hag obererezh enzimek ar polifenol oksidaz (PPO) a oa bet termenet goude bezañ bet reaktet gant 2,2 ml a 100 mM tampon fosfat sodiom (pH 6,00 mM), produioù kimiek 100 mM (CI, 100 mM). Portland, OR, SUA) ha 100 μl a 12 mM H2O2. Un tamm kemmet eo bet an doare diouzh (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Graet e oa bet an analizenn goude bezañ bet reaktet gant 3 ml a zisoc'h katekol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SUA) (0,01 M) nevez prientet e 0,1 M tampon fosfat (pH 6,0). Muzuliañ a reer obererezh CAT dre evezhiañ diskar H2O2 da 240 nm (A240), muzuliañ a reer obererezh POX dre evezhiañ kresk an absorbañs da 436 nm (A436), ha muzuliañ a reer obererezh PPO dre enrollañ ar c'hemmoù absorbañs da 495 nm (A495) bep 30 mn e-pad 30 munutenn en ur implijout ur spektrometr UV160 (Shimadzu, Japan).
Implijet e oa bet an RT-PCR e amzer wirion evit detektiñ liveoù treuzskrivañ teir gen liammet ouzh an enepoksidantoù, en o zouez ar c'hatalaz peroksisomal (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), ar superoksid dismutaz (PvSOD; GenBank Accession No. XM_0686395), hag ar glutaz 166 (GenBank Accession; KY195009.1), e delioù fav (an eil hag an trede delioù diorroet penn-da-benn eus an nec'h) 72 eurvezh goude an tretadenn ziwezhañ. E berr gomzoù, an ARN a oa bet dizoloet gant Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Sina) hervez protokol ar c'henderc'her. Neuze e voe sintezet an ADNc gant ar c'heflusker TOP scriptTM cDNA Synthesis Kit hervez titouroù ar c'henderc'her. Heuliadoù kentañ an tri gen meneget a-us a zo meneget e taolenn ouzhpenn S3. PvActin-3 (niverenn mont e-barzh GenBank : XM_068616709.1) a oa bet implijet evel gen-ti hag an eztaol gen keñverel a oa bet jedet dre implijout an doare 2-ΔΔCT (Livak ha Schmittgen, 2001). Diskouezet e oa bet stabilded an aktin dindan ar stress biotek (etregweredoù dic'houest etre al legumaj boutin hag ar c'hoñkour antracnose Colletotrichum lindemuthianum) hag ar stress abiotek (sec'hor, salinerezh, gwrezverk izel) (Borges et al., 2012).
Da gentañ hon eus graet un dielfennadur in silico dre ar genom eus proteinoù oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) e S. sclerotiorum dre implijout an ostilh protein-protein BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). E berr gomzoù, hon eus implijet OAH eus Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taksid: 1191702; niverenn mont e-barzh GenBank XP_040799428.1; 342 asid amino) ha Penicillium lagena (PlOAH; taksid: 942181; niverenn mont e-barzh GenBank; XP_056833920.1; 316 asid amino) evel heuliadoù goulenn evit kartennaouiñ ar protein heñvel e S. sclerotiorum (taksid: 5180). Graet e oa bet BLASTp a-enep ar roadennoù genom S. sclerotiorum a oa bet kavet nevez zo e GenBank war lec'hienn National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Ouzhpenn-se e oa bet tennet ar gen OAH rakwelet eus S. sclerotiorum (SsOAH) hag an dielfennadur emdroadurel hag ar wezenn filogenetek eus AfOAH eus A. fijiensis CBS 313.89 ha PlOAH eus P. lagena dre implijout an doare maximum likelihood e MEGA11 (Tamura et al., 2021) hag ar patrom diazezet war JTT (JTT et et. al., 1992). Ar wezenn filogenetek a oa bet kendeuzet gant an dielfennadur lieslinenn eus heuliadoù protein an holl genoù OAH rakwelet (SsOAH) eus S. sclerotiorum hag an heuliad goulenn dre implijout an ostilh aliañ diazezet war ar strishadurioù (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/kobalt/kobalt_) Agarwala, 2007). Ouzhpenn-se e oa bet liammet an heuliadoù aminoasidoù SsOAH eus S. sclerotiorum a glot gwellañ gant an heuliadoù goulenn (AfOAH ha PlOAH) (Larkin et al., 2007) dre implijout ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), ha gwelet e oa bet ar rannvroioù miret dre implijout an ESP ostilh (stumm 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Ouzhpenn-se e oa bet renket an domanioù fonksionel rakwelet hag al lec'hioù miret eus S. sclerotiorum SsOAH e familhoù disheñvel dre implijout an ostilh InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Erfin, ur patromadur framm tridimensionel (3D) eus ar SsOAH S. sclerotiorum rakwelet a oa bet graet dre implijout ar Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cid=index) (Kelley et al., et al. 2015) ha kadarnaet gant ar servijer SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Ar frammoù teirdimensionel rakwelet (stumm PDB) a oa bet gwelet en un doare etregwezhiat dre implijout ar pakad UCSF-Chimera (stumm 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
Implijet e oa bet ar PCR dre fluoresañs e-pad an amzer gwirion kementadel evit termeniñ live treuzskrivañ an oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; GenBank accession number: XM_001590428.1) e miseliom Sclerotinia sclerotiorum. E berr gomzoù, S. sclerotiorum a voe enlakaet en ur flask ennañ PDB ha lakaet en ur c'hoad-koad (model : I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, SUA) da 25 ± 2 °C e-pad 24 eurvezh da 150 troatad dre vunutenn hag en deñvalijenn bepred (24 eurvezh) evit broudañ kresk ar misel. Goude-se e voe tretet ar c'helligoù gant L-ornithine hag ar fongisid Rizolex-T e kresk IC50 diwezhañ (war-dro 40 ha 3,2 mg/L, hervez an urzh) ha goude-se e voe sevenet e-pad 24 eurvezh all dindan ar memes stadoù. Goude an enkubadur e voe sentrifuget ar sevenadurioù da 2500 rpm e-pad 5 munutenn ha dastumet e voe ar surnatant (miseliom fongek) evit an analizañ eztaol genetek. Heñvel, dastumet e oa bet miseliom fongek da 0, 24, 48, 72, 96 ha 120 eurvezh goude ar c'hleñved diwar plant kontammet o doa savet moul gwenn ha miseliom kotoñs war gorre ar gwiadoù kontammet. Tennet e voe an ARN eus ar miseliom fongek ha goude-se e voe sintezet an ADNc evel deskrivet a-us. An heuliadoù kentañ evit SsOAH a zo meneget e taolenn ouzhpenn S3. SsActin (niverenn mont e-barzh GenBank : XM_001589919.1) a oa bet implijet evel gen an tiegezh, hag an eztaol gen keñverel a oa bet jedet dre implijout an doare 2-ΔΔCT (Livak ha Schmittgen, 2001).
An asid oksalek a oa bet termenet e bouilhoñs dekstroz patatez (PDB) ha skouerennoù plant enno ar patogen fongek Sclerotinia sclerotiorum hervez doare Xu ha Zhang (2000) gant kemmoù bihan. E berr gomzoù, digenvezet S. sclerotiorum a voe enlakaet e-barzh flaskoù enno PDB ha goude-se e voe sevenet en ur c'hoad-koad (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, SUA) da 150 rpm da 25 ± 2 °C e-pad 3–5 devezh en deñvalijenn bepred (24 eurvezh) evit stimulañ kresk ar misel. Goude an enkubadur e voe silet ar sevenadur fongus da gentañ dre baper-sil Whatman #1 ha goude-se e voe greizennet da 2500 rpm e-pad 5 munutenn evit tennañ ar miseliom a chome. Dastumet e voe ar surnatant ha miret da 4°C evit termeniñ muioc'h an oksalat. Evit prientiñ ar skouerennoù plant e voe tennet war-dro 0,1 g a dammoù gwiad plant teir gwech gant dour strilhañ (2 ml bep tro). Neuze e voe greizennet ar skouerennoù da 2500 rpm e-pad 5 munutenn, ar surnatant a voe silañ sec'h dre baper-sil Whatman No. 1 ha dastumet evit an dielfennañ pelloc'h.
Evit an dielfennadur kementadel eus an asid oksalek e oa bet prientet ar meskaj reaktadur en ur c'houblad gwer gant ur c'hrog en urzh da-heul : 0,2 ml a skouerenn (pe sil sevenadur PDB pe disoc'h skoueriek asid oksalek), 0,11 ml a glas bromofenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, SUA, PA, Ml 1919). asid sulfurek (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) ha 0,176 ml a dikromat potasiom 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, SUA), ha goude-se e voe diluet an disoc'h betek 48 mM dour distilhet ha mesket kreñv. lakaet diouzhtu en ur banne dour 60 °C. Goude 10 munutenn e voe paouezet gant an argerzh en ur ouzhpennañ 0,5 ml a zisoc'h hidroksid sodiom (NaOH; 0,75 M). Muzuliañ a reer absorbañs (A600) ar meskaj reaktadur da 600 nm gant ur spektrofotometr UV-160 (Shimadzu Corporation, Japan). Implijet e voe PDB ha dour strilhañ evel kontrolloù evit muzuliañ ar siloù sevenadurel hag ar skouerennoù plant, hervez an urzh. Ar c'hementad asid oksalek er sildoù sevenadurel, eztaolet evel mikrogrammoù asid oksalek dre mililitrad a endro PDB (μg.mL−1), hag en tennadoù delioù, eztaolet evel mikrogrammoù asid oksalek dre gramm pouez fresk (μg.g−1 FW), a oa bet termenet dre implijout ur c'hrommenn asid oksalek (The Firmors Scientific Chemicals, Waltham, MA, SUA).
A-hed ar studiadenn e oa bet savet an holl arnodoù en un doare dre zegouezh penn-da-benn (CRD) gant c'hwec'h eiladenn biologel dre dresadenn ha pemp pod dre eiladenn biologel (daou blantenn dre pod) nemet pa oa bet meneget un dra all. An eiladennoù biologel a oa bet dielfennet e div wech (daou eiladenn deknikel). Implijet e voe eiladennoù teknikel evit gwiriañ adproduiñ ar memes arnod met n'int ket bet implijet en dielfennadur stadegel evit mirout ouzh eiladennoù faos. Anavezout a reer ar roadennoù dre stadegoù dre implijout an analizenn diforc'h (ANOVA) heuliet gant an test Tukey-Kramer a-fet diforc'h onest (HSD) (p ≤ 0,05). Evit an arnodoù in vitro e oa bet jedet talvoudoù IC50 hag IC99 dre implijout ar patrom probit ha jedet e oa bet etrefasoù fiziañs 95%.
En holl e oa bet dastumet pevar digenvez eus tachennoù soja disheñvel e gouarnamant El Ghabiya, en Egipt. War ar metoù PDA e produas an holl izoladoù miseliom gwenn krem ​​a zeuas buan da vezañ gwenn kotoñs (Skeudenn 1A) ha goude-se da vezañ beige pe gell er mare sklerotiom. Stank, du, sferek pe direizh eo ar sklerotioù peurliesañ, 5,2 da 7,7 mm hirder ha 3,4 da 5,3 mm treuzkiz (Skeudenn 1B). Daoust ma oa bet diorroet gant pevar digenvez ur patrom marzhinel a sklerotioù e ribl ar metoù sevenadurel goude 10–12 devezh enkubadur da 25 ± 2 °C (Skeudenn 1A), e oa disheñvel-tre an niver a sklerotioù dre bladenn etrezo (P < 0,001), gant an digenvez 3 o kaout an niver uhelañ a sklerotied (33 ± 33.000). sclerotia dre bladenn; Fig. 1C). Heñvel, an digenvez #3 a broduas muioc'h a asid oksalek e PDB eget an digenvez all (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). Diskouez a rae an digenvez #3 perzhioù morfologel ha mikroskopek stank ar fungus fitopatogenek Sclerotinia sclerotiorum. Da skouer, war ar PDA, e kreske buan trevadennoù an digenvez #3, gwenn krem ​​(Skeudenn 1A), beige en-dro pe melen-gell salmon sklaer, ha ret e oa 6-7 devezh da 25 ± 2°C evit goleiñ penn-da-benn gorre ur bladenn 9 cm treuzkiz. Diazezet war ar perzhioù morfologel ha mikroskopek meneget a-us e oa bet anavezet an digenvez #3 evel Sclerotinia sclerotiorum.
Skeudenn 1. Perzhioù ha patogeniezh an digenvezed S. sclerotiorum eus plant legumaj boutin. (A) Kresk miseliel pevar digenvez S. sclerotiorum war metoù PDA, (B) sklerotioù pevar digenvez S. sclerotiorum, (C) niver a sklerotioù (dre bladenn), (D) sekredur asid oksalek war metou PDB (μg.mL−1), ha (E) grevusded ar c'hleñved (%) pevar digenvez S. sclerotiorum kizidik war ar c'horf kenwerzhel. ar seurt Giza 3 dindan an ti-gwer. Ar gwerzhioù a zastum ar geidenn ± SD eus pemp eiladenn biologel (n = 5). Lizherennoù disheñvel a ziskouez diforc'hioù stadegel etre an tretañ (p < 0,05). (F–H) Sintomoù moull gwenn stank a zeuas war wel war ar c'hefoù hag ar silikoù a-us d'an douar, hervez an urzh, 10 devezh goude an enlakaat gant an digenvez #3 (dpi). (I) An analizenn emdroadur eus rannvro treuzskrivet diabarzh (ITS) an digenvez #3 eus S. sclerotiorum a oa bet graet dre implijout an doare maximum likelihood ha keñveriet gant 20 digenvez/strollad dave bet tapet diwar diaz roadennoù ar National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.h.v./). An niveroù a-us d'al linennoù strollañ a ziskouez golo ar rannvro (%), hag an niveroù dindan al linennoù strollañ a ziskouez hirder ar skourr.
Ouzhpenn-se, evit kadarnaat ar patogeniezh, e voe implijet pevar digenvez S. sclerotiorum bet tapet evit enlakaat ar seurt fav kenwerzhel Giza 3 a c'hallfe bezañ kizidik dindan an ti-gwer, ar pezh a glot gant postuladoù Koch (Skeudenn 1E). Daoust ma oa an holl izeladurioù fongek bet tapet patogenek ha ma c'hallent infektañ ar fav glas (cv. Giza 3), o lakaat sintomoù moull gwenn tipikel war an holl lodennoù a-us d'an douar (Skeudenn 1F), dreist-holl war ar c'hefoù (Skeudenn 1G) hag ar podoù (Skeudenn 1H) 10 devezh goude an inokuladur (pig. 3), an izeladur tagusañ e oa an izeladur (pig. 3 daou arnod dizalc'h. An digenvez 3 en doa ar c'hleñved uhelañ (%) war ar plant fav (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0, ha 76,7 ± 3,1 da 7, 14 ha 21 devezh goude ar c'hleñved, hervez an urzh; Skeudenn 1F).
Kadarnaet e oa bet anavezadur an digenvez S. sclerotiorum #3 ar muiañ en em ledañ diwar heuliañ an etrefasoù treuzskrivet diabarzh (ITS) (Skeudenn 1I). An analizenn filogenetek etre an digenvez #3 hag an digenvez/strollad 20 a ziskouezas heñvelderioù uhel (>99%) etrezo. Ret eo menegiñ eo heñvel-tre an digenvez S. sclerotiorum #3 (533 bp) ouzh an digenvez S. sclerotiorum amerikan LPM36 dizoloet diwar hadoù piz sec'h (niverenn mont e-barzh GenBank MK896659.1; 540 bp) hag an digenvez S. sclerotiorum sinaat YK896659.1; 540 pb) hag an digenvez S. sclerotiorum sinaat YK896659.1 (GenBank OR206374.1; 548 bp), ar pezh a laka ar c'hef violet (Matthiola incana) da vezañ brein, an holl anezho strollet war-eeun e penn uhelañ an dendrogramm (Skeudenn 1I). Lakaet eo bet an heuliad nevez e diaz roadennoù an NCBI hag anvet eo bet "Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25" (niverenn degemer GenBank PV202792). Gwelet a reer eo an digenvez 3 an digenvez alouber ar muiañ ; dre-se e voe dibabet an digenvez-se evit bezañ studiet en holl arnodoù da-heul.
En vitro e oa bet studiet obererezh enepbakteriel an diamin L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alamagn) e kementadoù disheñvel (12,5, 25, 50, 75, 100 ha 125 mg/L) a-enep S. sclerotiorum isolate 3. Merzout a reer e oa bet gant L-ornitin un efed enepbakteriel hag e oa bet harzet tamm-ha-tamm kresk radial hifoù S. sclerotiorum en un doare diouzh ar c'hementad (Skeudenn 2A, B). Er c'hementad uhelañ bet amprouet (125 mg/L), L-ornitin a ziskouezas ar feur harz uhelañ war ar c'hresk miseliom (99,62 ± 0,27%; Skeudenn 2B), ar pezh a oa kevatal d'ar fongisid kenwerzhel Rizolex-T (feur stankañ 99,45 ± 0,39%; Skeudenn 2C) er c'hementad uhelañ amprouet (10 mg/L), ar pezh a oa bet amprouet (Skeudenn 2B). o tiskouez un efedusted heñvel.
Skeudenn 2. Obererezh enepbakteriel in vitro L-ornithine a-enep Sclerotinia sclerotiorum. (A) Keñveriañ obererezh enepbakteriel kementadoù disheñvel a L-ornitin a-enep S. sclerotiorum gant ar fongisid kenwerzhel Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Feur harz (%) kresk miseliom S. sclerotiorum goude bezañ bet tretet gant kementadoù disheñvel a L-ornithine (12,5, 25, 50, 75, 100 ha 125 mg/L) pe Rizolex-T (2, 4, 6, 8 ha 10 mg/L), hervez an urzh. Ar gwerzhioù a zastum ar geidenn ± SD eus pemp eiladenn biologel (n = 5). Lizherennoù disheñvel a ziskouez diforc'hioù stadegel etre an tretañ (p < 0,05). (D, E) Dielfennadur distro ar patrom Probit eus L-ornitin ha fongizid kenwerzhel Rizolex-T, hervez an urzh. Diskouezet eo linenn distreiñ ar patrom probit evel ul linenn c'hlas solut, hag an etrefas fiziañs (95%) evel ul linenn ruz strizh.
Ouzhpenn-se e oa bet graet un dielfennadur dre zistreiñ probit hag ar grafikoù a glot ganto a zo diskouezet e taolenn 1 ha skeudennoù 2D,E. E berr gomzoù, ar werzh stouadur degemerus (y = 2,92x − 4,67) hag ar stadegoù pouezus stag outañ (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 ha p < 0,0001; Skeudenn 2D) eus L-ornithine a ziskouezas un obererezh enep-fongek kreñvaet a-enep ar c'hreiz Srokel. fongisid Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 ha p < 0,0001) (Taolenn 1).
Taolenn 1. Talvoudoù ar c'hresk hanter-uhelañ (IC50) hag IC99 (mg/l) eus L-ornitin ha fongisid kenwerzhel “Rizolex-T” a-enep S. sclerotiorum.
Dre vras, L-ornitin (250 mg/L) a zigreskas kalz diorren ha pouez ar moull gwenn war plant fav boutin tretet e-keñver plant na oant ket bet tretet gant S. sclerotiorum (kontrol; Skeudenn 3A). E berr gomzoù, daoust ma oa kresket tamm-ha-tamm pouez ar c'hleñvedoù gant ar plant kontroll ha n'int ket bet tretet (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, ha 92,33 ± 3,06%), e oa bet digresket kalz pouez ar c'hleñved (%) gant L-ornitin a-hed an arnod (8,97 ± 1,53, 83,21 ± 2,06, ha 1,00 ± 3,06%). 26,36 ± 3,07) da 7, 14 ha 21 devezh goude an tretañ (dpt), hervez an urzh (Skeudenn 3A). Heñvel, pa oa bet tretet ar plant fav klañv gant S. sclerotiorum gant 250 mg/L L-ornitin, e oa digresket an dachenn dindan ar c'hrommenn araokaat ar c'hleñved (AUDPC) eus 1274,33 ± 33,13 er c'hontroll na oa ket bet tretet da 281,03 ± 7,95, ar pezh a oa izeloc'h eget hini ar c'hontroll 50 mg/L fongizid Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). Ar memes tu a oa bet gwelet en eil arnod.
Skeudenn 3. Efed an implij diavaez eus L-ornitin war diorren ar brein gwenn eus ar fav boutin degaset gant Sclerotinia sclerotiorum e-barzh an ti-gwer. (A) Krommenn mont war-raok ar c'hleñved eus ar moul gwenn eus ar fav boutin goude bezañ bet tretet gant 250 mg/L L-ornitin. (B) Gorread dindan ar c'hrommenn mont war-raok ar c'hleñved (AUDPC) eus ar moul gwenn eus ar fav boutin goude bezañ bet tretet gant L-ornitin. Ar gwerzhioù a zastum ar geidenn ± SD eus pemp eiladenn biologel (n = 5). Lizherennoù disheñvel a ziskouez diforc'hioù stadegel etre an tretañ (p < 0,05).
Implijout 250 mg/L L-ornitin en un doare diavaez a greskas tamm-ha-tamm uhelder ar plant (Skeudenn 4A), an niver a skourroù dre blantenn (Skeudenn 4B), hag an niver a delioù dre blantenn (Skeudenn 4C) goude 42 devezh. Tra ma oa bet an efed brasañ gant ar fongisid kenwerzhel Rizolex-T (50 mg/L) war an holl barametroù boued studiet, e oa bet an eil efed brasañ gant an implij diavaez eus 250 mg/L L-ornitin e-keñver ar c'hontrolloù hep tretañ (Skeudennoù 4A–C). War un dro, an tretañ gant L-ornitin n'en deus bet efed pouezus ebet war endalc'had ar pigmantoù fotosintetek klorofil a (Skeudenn 4D) ha klorofil b (Skeudenn 4E), met kresket en deus un tamm an endalc'had karotenoid hollek (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) e-keñver ar c'hontroll negativel (0,44 ± 0,03 mg/g fr wt) pozitivel ha pozitivel. kontroll (0,46 ± 0,02 mg/g fr wt; Fig. 4F). Dre vras, an disoc'hoù-se a ziskouez n'eo ket fitotoksik an L-ornitin evit al legumaj tretet ha gallout a ra zoken broudañ o c'hresk.
Skeudenn 4. Efed an implij L-ornitin diavaez war perzhioù kresk ha livioù fotosintetek delioù fav klañv gant Sclerotinia sclerotiorum e-barzh an ti-gwer. (A) Uhelder ar plant (cm), (B) Niver a skourroù dre blantenn, (C) Niver a delioù dre blantenn, (D) Danvez klorofil a (mg g-1 fr wt), (E) Danvez klorofil b (mg g-1 fr wt), (F) Danvez karotenoid hollek (mg g-1 fr wt). Ar gwerzhioù eo ar geidenn ± SD eus pemp eiladenn biologel (n = 5). Lizherennoù disheñvel a ziskouez diforc'hioù stadegel etre an tretañ (p < 0,05).
Lec'hiadur histokimiek in situ ar spesadoù oksigen reaktivel (ROS; eztaolet evel peroksid hidrogen [H2O2]) hag ar radikaloù frank (eztaolet evel anionoù superoksid [O2•−]) a ziskouezas e oa bet digresket kalz an daspugn H250 mg/L (250 mg/L) gant an implij eksogen eus L-ornitin (250 mg/L) (250 ± 355 . nmol.g−1 FW; Fig. 5A) hag O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) e-keñver an daspugn eus ar plant klañv hep tretañ (173,31 ± 12,06 ha 149,35 ± 7,94 nl.g−1 FW, hervez o urzh) ha plant tretañ mg/L eus ar fongisid kenwerzhel Rizolex-T (170,12 ± 9,50 ha 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, hervez an urzh) da 72 eurvezh. Liveoù uhel a H2O2 hag O2•− a oa bet dastumet dindan hpt (Skeudenn 5A, B). Heñvel, an analizenn malondialdehid (MDA) diazezet war TCA a ziskouezas e oa bet dastumet liveoù uheloc'h a MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) en o delioù gant ar plant fav gloazet gant S. sclerotiorum (Skeudenn 5C). Koulskoude, implij diavaez L-ornitin a zigreskas kalz ar peroksidadur lipidek evel ma tiskouez an digresk en endalc'had MDA er plant tretet (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Skeudenn 5. Efed an implij L-ornitin diavaez war merkoù pennañ ar stress oksidativel hag ar mekanikoù difenn enepoksidant nann-enzimatek e delioù fav gloazet gant S. sclerotiorum 72 eurvezh goude ar c'hleñved e-barzh an ti-gwer. (A) Peroksid hidrogen (H2O2; nmol g−1 FW) da 72 hpt, (B) anion superoksid (O2•−; nmol g−1 FW) da 72 hpt, (C) malondialdehid (MDA; nmol g−1 FW) da 72 hpt, (D) fenol dizoloet hollek (GAE g−1 FW) da 72 hpt hpt, (E) hollad flavonoidoù dizoloet (mg RE g−1 FW) da 72 hpt, (F) hollad aminoasidoù frank (mg g−1 FW) da 72 hpt, ha (G) endalc'had prolin (mg g−1 FW) da 72 hpt. Ar gwerzhioù a zastum ar geidenn ± an diforc'h skoueriek (keidenn ± SD) eus 5 eiladenn biologel (n = 5). Lizherennoù disheñvel a ziskouez diforc'hioù stadegel etre an tretañ (p < 0,05).