Ret-holl eo renkañ ar proteinoù en hent sekretour evit mirout ar c'hompartimantadur hag an homeostaz kelligoù. Ouzhpenn ar renkañ dre c'hrogenn, perzh al lipidoù e renkañ ar c'hinesin e-kerzh an treuzdougen sekretour zo ur goulenn diazez a-hed an amzer ha n'eo ket bet respontet dezhañ c'hoazh. Amañ e reomp skeudennoù 3D liesliv war un dro gant ur resolution uhel e amzer wirion evit prouiñ in vivo e vez strollet ha renket proteinoù nevez-sintezet gant glikozilfosfatidilinositol dilec'hiet gant lodennoù lipidoù ceramid hir-tre e-barzh endoplasmoù arbennikaet Net exit lec'h, ar pezh a zo disheñvel diouzh an hini implijet gant ar proteinoù treuzmembranek. Ouzhpenn-se e tiskouezomp eo pouezus-kenañ hirder chadenn ar c'heramid e grogenn ar rouedad endoplasmek evit an dibab renkañ-se. Ar studiadenn a ginnig an testenioù in vivo kentañ evit renkañ ar c'hargoù protein diouzh hirder ar chadenn lipidek e lec'hioù ezporzhiañ diuzet en hent sekretour.
Er c'helligoù eukariot e vez renket ar proteinoù sintezet er rouedad endoplasmek (ER) e-pad an treuzdougen dre an hent sekretour evit bezañ kaset d'o lec'h kelligel dereat (1). Ouzhpenn ar renkañ dre ar gwiskad e oa bet soñjet abaoe pell e c'hallfe lipidoù resis servijout ivez da boentoù mont-kuit diuzet dre o strollañ e domanioù membranenn resis eget proteinoù resis (2-5). Koulskoude, ez eus c'hoazh un diouer a brouennoù reizh in vivo evit prouiñ ar mekanik diazezet war al lipidoù posupl-se. Evit diskoulmañ ar gudenn diazez-se hon eus studiet er goell penaos e vez ezporzhiet en un doare disheñvel ar proteinoù staget ouzh ar glikozilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-APs) diouzh an ER. GPI-APs zo ur bern proteinoù gorre ar c'helligoù liammet ouzh lipidoù ( 6, 7). GPI-AP zo ur protein skarzhet stag ouzh follennoù diavaez ar grogenn plasma dre al lodenn glikolipid (ankoù GPI). Degemer a reont an ankoù GPI evel kemmoù goude-treiñ gwarezour e lumen an ER (8). Goude bezañ staget e tremen GPI-AP dre ardivink Golgi (5, 9) eus an ER betek ar grogenn plasma. Bezañs an ankoù GPI a laka GPI-AP da vezañ treuzkaset diouzh ar proteinoù sekret dre dreuzfollenn (en o zouez proteinoù all eus ar membran plasma) a-hed an hent sekret (5, 9, 10). E kelligoù ar goell e vez dispartiet ar GPI-APoù diouzh ar proteinoù all skarzhet er rouedad endoplasmek, ha goude-se e vezont paket e vezikel dibar paket gant ar c'hemplezh protein II (COPII) (6, 7). N'eo ket sklaer petra a ziviz an argerzh renkañ-mañ en argerzh ezporzhiañ an ER, met soñjal a reer e c'hallfe ar mekanik-se kaout ezhomm eus lipidoù, dreist-holl adkempenn frammadurel lodenn lipidek an eor GPI (5, 8). Er goell e krog an adkempenn lipidoù GPI diouzhtu goude ma vez staget ar GPI, hag e meur a geñver e laka ar c'heramid da stagañ ouzh an asid druz hir-chadenn 26 karbon (C26:0) (11, 12). Ar c'heramid C26 eo ar c'heramid pennañ produet gant kelligoù ar goell betek-henn. Sintezet e vez en ER hag ezporzhiet e vez an darn vrasañ anezhañ d'an dafar Golgi dre vezikel COPII (13). An ezporzhiadur ER eus GPI-AP a c'houlenn dreist-holl ur sintezenn keramid a-hed an amzer (14, 15), hag en e dro, treuzfurmiñ ar ceramid e keramid fosfat inositol (IPC) en ardivink Golgi a zalc'h ouzh sintezenn ankoù GPI (16). Studioù biofizikel gant membranoù artifisiel o deus diskouezet e c'hall ar c'heramidoù chadenn asil hir-tre en em vodañ evit sevel tachennoù urzhiet gant perzhioù fizikel dibar (17, 18). Ar roadennoù-se a gas d'an hipotezenn e implij ar C26 ceramide hag ar GPI-AP gant C26 ceramide o perzhioù fizikel evit en em vodañ e rannvroioù pe rannvroioù urzhiet en endro lipidikel ER a-walc'h a-feson. Savet eo dreist-holl diwar gliserolipidoù berr ha dic'hortoz (C16:1 ha C18:1) (19, 20). Diuzet e vo ar rannvroioù-se war lec'hioù mont-kuit ER resis (ERES), ma c'hallo ar c'heramid hag ar GPI-AP diazezet war ar c'heramid bezañ kentreuzkaset d'ar Golgi er memes vesikel COPII gouestlet (5).
Er studiadenn-mañ hon eus amprouet war-eeun ar mekanik-se diazezet war al lipidoù dre implijout ar mikroskopiezh skeudenniñ amzer-gwirion konfokal dreist-disoc'h (SCLIM), hag a zo un teknik mikroskopiezh a-vremañ a c'hell sellet ouzh proteinoù merket gant fluoresañs war un dro.
Da gentañ hon eus implijet an teknologiezh SCLIM evit termeniñ muioc'h penaos e oa bet skrammet GPI-AP normal gant strollad ceramide C26 diwar proteinoù sekretet dre dreuzfollenn goude bezañ kuitaet an ER e S. cerevisiae. Evit gwiriañ renkadur an ER hon eus implijet ur reizhiad genetek a c'hell gwelet war-eeun ar c'hargoù nevez-sintezet o vont e-barzh an ERES in vivo (7, 23). Evel karg, hon eus dibabet GPI-AP Gas1 diazezet war ar c'heramid C26 merket gant protein fluoreskant glas (GFP) ha protein Mid2 sekretet dre dreuzfollenn merket gant protein fluoreskans tost-infraruz (iRFP), an daou anezho a denn d'ar grogenn plasma (24–26). Er c'hemm sec31-1 kizidik ouzh an temperadur e vez eztaolet an daou garg-se dindan ur bromoter galaktoz-induziñ hag ur merker ERES diazez. D'an temperadur uhel (37°C), dre ma vez efedus ar c'hemm sec31-1 war arc'hwel elfenn golo COPII Sec31 evit harzañ ar c'hrouiñ COPII hag an ezporzhiañ ER, e vez dastumet kargoù nevez-sintezet en ER (23). Goude bezañ bet yenaet betek un temperadur izel (24°C), e adkavas ar c'helligoù mutant sec31-1 eus an dachenn sekretour, hag ar c'hargoù sintetek nevez dastumet a grogas da vezañ ezporzhiet eus an ER. Ar gweledva CLIM a ziskouezas e oa c'hoazh dastumet an darn vrasañ eus ar Gas1-GFP ha Mid2-iRFP nevez-sintezet en ER ar c'helligoù mutant sec31-1 goude bezañ bet goret da 37°C ha goude-se bet skarzhet da 24°C e-pad 5 munutenn (Skeudenn 1). Dre ma vez skignet Mid2-iRFP war ar grogenn ER a-bezh, ha ma vez strollet ha dastumet Gas1-GFP e tachenn ar grogenn ER distag, eo disheñvel-mik o zasparzh (Skeudenn 1, A da C ha Film S1). Ouzhpenn-se, evel m'eo diskouezet e skeudenn 1D, n'eus ket Mid2-iRFP er strollad Gas1-GFP. Diskouez a ra an disoc'hoù-se e oa bet dispartiet ar proteinoù GPI-AP ha treuzmembranek e rannvroioù disheñvel eus ar membranenn ER a-raok. Emañ ar strollad Gas1-GFP e-kichen un ERES resis merket gant protein golo COPII mCherry Sec13 (Skeudenn 1, E ha F, ha film S1) (23).
ar c'helligoù sec31-1 a eztaol sekredoù broudet gant ar galaktoz, ur chadenn asil hir (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, glas) hag ar protein treuzmembranek Mid2-iRFP (TMP, glas) hag an tikedenn ERES sevel-mañ Sec13-mCherry (E) a oa bet maget e 30 C munutenn, dilec'hiet da 24°C, ha skeudennaouet gant SCLIM 5 munutenn diwezhatoc'h. (A da C) a ziskouez ur skeudenn 2D kendeuzet pe unvan eus ur plankenn (A), ur skeudenn rakwelet 2D eus 10 z-rann (B) pe ur skeudenn 3D eus hantervoul ar c'helligoù eus merkoù kargoù hag ERES (C). Barrenn skeul 1μm (A ha B). 0,551 μm (C) eo an unanenn skeul. Gas1-GFP a oa bet detektet e rannvroioù pe strolladoù ER distag, tra ma oa bet detektet Mid2-iRFP ha skignet dre ar grogenn ER (C). (D) Ar grafik a ziskouez nerzh fluoresañs keñverel Gas1-GFP ha Mid2-iRFP er strollad Gas1-GFP a-hed al linenn bir gwenn (kleiz). AU, unanenn a-ratozh. (E ha F) a zastum ar skeudenn 3D a zastum ar marc'hadourezh hag ar merk ERES. Kavet e oa bet strolladoù Gas1-GFP e-kichen an ERES resis. 0,551μm eo an unanenn skeul. (F) Ar bir gwenn a verk ar strollad Gas1-GFP liammet ouzh ERES. Ar panelloù kreiz ha dehou a ziskouez ar skeudenn 3D brasaet kendeuzet hag ur gwel troet eus ar strollad Gas1-GFP diuzet.
An darempred egorel tost etre ar strollad Gas1-GFP hag un ERES resis a ziskouez e c'hall Gas1-GFP mont e-barzh ERES diuzet, ar pezh a zo disheñvel diouzh an diuzañ implijet gant Mid2-iRFP evit kuitaat an ER. Evit diskoulmañ ar c'hementad-se hon eus muzuliet ar feur ERES evit unan pe daou dra hepken (Skeudenn 2, A da C). Kavet hon eus ne oa nemet ur seurt karg en darn vrasañ eus an ERES (70%). Skeudenn izelañ ar skeudenn 2C a ziskouez daou skouer stank eus ERES gant Gas1-GFP hepken (skeudenn 1) pe Mid2-iRFP hepken (skeudenn 2). Er c'hontrol, war-dro 20% eus an ERES a endalc'h daou garg a glot gant an hevelep tachenn. Kavet e oa bet e oa daou seurt kargoù e lod eus an ERESoù (10%), met digenvez e oant e lec'hioù disheñvel-tre. Dre-se e tiskouez an dielfennadur stadegel-mañ goude ma vo ezporzhiet an ER e vez rannet GPI-AP Gas1-GFP hag ar c'harg treuzmembran Mid2-iRFP e ERES disheñvel (Skeudenn 2D). An efedusted renkañ-se a glot-tre gant an dielfennadur biokimiek (6) hag an termenadur morfologel (7) a-raok. Gallout a reomp ivez sellet ouzh emzalc'h ar c'hargoù lakaet e karantez o vont e-barzh ERES (Skeudenn 2E ha Film S2). Ar skeudenn 2E a ziskouez n'eus nemet ul lodenn vihan eus Gas1-GFP (panel 3) pe Mid2-iRFP (panel 4) a ya e-barzh an ERES diwar un tu hag a zo stanket en un dachenn distag. Panell 5 ar skeudenn 2E a ziskouez e vez kavet Gas1-GFP ha Mid2-iRFP a-wechoù er memes ERES, met mont a reont e-barzh eus tuoù disheñvel ha strollet e vezont e rannvroioù disheñvel a c'hellfe bezañ vezikel COPII disheñvel. Kadarnaet hon eus ivez eo spesadel an disparti hag ar renkadur gwelet eus GPI-AP Gas1 diazezet war C26 ceramide evel ERES diuzet rak ur c'harg all a sekredur treuzmembranek, ar protein plasma merket gant GFP Axl2 (27 ), a ziskouez emzalc'h heñvel ouzh hini Mid2-iRFP. (Skeudenn S1 ha Film S3). An Axl2-GFP nevez-sintezet a vez skignet dre ar grogenn ER evel Mid2-iRFP (Skeudenn S1, A ha B), hag a vez kenlec'hiet gant Mid2-iRFP en darn vrasañ eus an ERES (Skeudenn S1, B da D). Panelloù 1 ha 2 ar skeudenn 1. S1C a ziskouez daou skouer tipikel eus ERES ma vez daou garg treuzmembranek o klotañ. Er c'houlzadoù-se e teu an daou varc'hadourezh e-barzh ERES asambles (Skeudenn S1E, Panell 3 ha Film S3).
Lakaet e voe ar c'helligoù sec31-1 a eztaol ar sekredoù galaktoz, Gas1-GFP (GPI-AP, glas) ha Mid2-iRFP (TMP, glas) hag an tikedennoù ERES diazez Sec13-mCherry (ERES, magenta) da 37 Goude bezañ bet enkubet e-pad 30 munutenn da 24 °C, e voe dilec'hiet ar skeudenn ha stanket an ion gant SCLIM goude 20 munutenn. (A da C) Skeudennoù rakwelet 2D arouezius (A; barrenn skeul, 1μm) pe skeudennoù hantervoul kelligel 3D (B ha C; unanenn skeul, 0,456μm) eus ar c'harg ha 10 z-rann merket gant ERES. Ar banell izelañ e (B) hag ar banell e (C) a ziskouez skeudennoù treuzfurmet evit diskouez nemet ar madoù a gaver en ERES (magent) [Gas1-GFP (gris) ha Mid2-iRFP (glas sklaer)]. (C) Saezh digor : ERES ne zoug nemet un tamm karg (1 da 4). Saezh gris : ERES a endalc'h kargoù dispartiet (5). Saezh gwenn : ERES ennañ kargoù lec'hiet a-gevret. Dindan : An ERES diuzet n'en deus nemet Gas1-GFP (1) pe Mid2-iRFP (2). Barrenn ar skeul, 100 nm. (D) Kementadur ar fotomikrograf deskrivet e (C). Ar c'hresk keitat eus an ERES a endalc'h ur c'harg hepken (Gas1-GFP pe Mid2-iRFP), karg dispartiet ha karg dreist-holl. E-kerzh teir arnod dizalc'h, n=432 e 54 kellig. Barrenn fazi = SD. Test t div-skourr hep par. *** P = 0,0002. (E) Skeudenn 3D eus ERES dibabet ar c'hargoù lakaet e karantez merket gant (C). Gas1-GFP (glas) (3) pe Mid2-iRFP (glas) (4) a ya e-barzh ERES (magent) diwar un tu hag a zo bevennet d'un dachenn vihan e-barzh ERES. Alies e vez an daou seurt kargoù o vont e-barzh ar memes ERES (5) eus an hevelep tu hag e vezont stanket en ul lec'h digenvez e-barzh an ERES. Barrenn ar skeul, 100 nm.
Da c'houde, hon eus amprouet un hipotezenn a lavar e vez kaset gant ar c'heramid chadenn asil hir (C26) a gaver er grogenn ER ar c'hlusteriñ hag ar renkañ spesadel eus Gas1 en ERES diuzet. Evit se hon eus implijet ur spesad goell GhLag1 kemmet, ma oa bet erlec'hiet an div sintezenn seramid endogen Lag1 ha Lac1 gant GhLag1 (homolog Lag1 ar c'hoton), ar pezh a zegasas ur spesad goell gant ur spesad Ceramid membranenn gellig berroc'h eget ar seurt gouez (Skeudenn 3A) (28). An analizenn dre spektrometriezh tolz (MS) a ziskouezas e oa 95% eus ar c'heramid hollek ur chadenn hir-tre (C26) e-barzh ar spesadoù gouez, tra ma oa 85% eus ar c'heramid hir-tre (C18 ha C16) e GhLag1. ), 2% hepken eus ar c'heramid a zo ur chadenn hir-tre (C26) eus ar c'heramid. Daoust ma'z eo ar c'heramidoù C18 ha C16 ar c'heramidoù pennañ bet kavet e-barzh ar grogenn GhLag1 betek-henn, an analizenn MS en deus kadarnaet ivez e oa en eor GPI Gas1-GFP eztaolet er strollad GhLag1 seramid C26, a c'haller keñveriañ gant lipidoù ar seurt gouez. An hevelep kalite eo (Skeudenn 3A) (26). Dre-se e talvez kement-se eo diuzet-kenañ an enzim adkempenn ceramid Cwh43 evit ar ceramid C26, evel m'eo diskouezet e skeudenn 26, enkorfañ a ra dreist-holl an eor GPI diwar ur c'hementad bihan a ceramid C26 er spesad GhLag1. S2 (29). Koulskoude, n'eus nemet C18-C16 keramid e-barzh ar grogenn gellig GhLag1, tra ma'z eus c'hoazh C26 ceramide e Gas1-GFP. Ar fed-se a laka ar spesad-mañ da vezañ un ostilh mat evit diskoulmañ dreist-holl kudenn hirder chadenn asil ar c'heramid membran en ER. Roll ijinel ar c'hlas hag ar renkañ. Neuze, hon eus studiet da gentañ galloud C26 Gas1-GFP da zastum e strolladoù e GhLag1 gant un allel mutant kizidik ouzh an temperadur eus sec31-1 dre ur mikroskopiezh fluoresañs hengounel, ma n'eus nemet an enkadenn hir (C18-C16) e membran ER Ceramide (Skeudenn 3). Gwelet hon eus e oa strollet an darn vrasañ eus Gas1-GFP e sec31-1 e strolladoù, tra ma oa Gas1-GFP e sec31-1 GhLag1 gant ur grogenn ER ceramide hir (C18-C16) hir ha ne oa ket strollet dreist-holl ha skignet e-barzh ar grogenn ER a-bezh. Evit bezañ resis, dre ma'z eo liammet-tre ar c'hlusteriñ diazezet war ar c'heramid C26 ouzh an ERES resis (Skeudenn 1), hon eus enklasket da c'houde hag-eñ e c'hallfe an argerzh-se kemer perzh ivez e fonksion ar mekanik protein ezporzhiañ ER. GPI-AP a implij ur reizhiad COPII ispisial evit ezporzhiañ ER, a vez reoliet oberiant gant adkempenn frammadurel Ted1 eus lodenn glikan an eor GPI (30, 31). Anavezet e vez neuze ar GPI-glikan adkempennet gant ar c'hemplezh p24 resever kargoù treuzmembranek, hag a rec'h Lst1 en un doare diuzet, hag a zo un izoform resis eus an isunanenn stagañ kargoù COPII pennañ Sec24, o sevel ur COPII pinvidik e GPI-AP. Ret eo kaout vezikel (31-33). Setu perak hon eus savet ur c'hemm doubl a vod dilemel ar proteinoù unvan-se (ar perzh kemplezh p24 Emp24, an enzim adkempenn GPI-glikan Ted1 hag an isunanenn COPII spesadel Lst1) gant ar spesad kemm sec31-1, ha studiet hon eus anezho Hag-eñ eo posupl sevel Gas1-Luster GFP (Skeudenn 33). Gwelet hon eus e sec31-1emp24Δ ha sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP dreist-holl hep strollañ ha skignet dre ar grogenn ER, evel ma oa bet gwelet a-raok e sec31-1 GhLag1, tra ma oa e sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Like sec31-1-1. Diskouez a ra an disoc'hoù-se e rank ar c'hlusteriñ Gas1-GFP stagañ ouzh ar c'hemplezh p24, ouzhpenn bezañs ceramide C26 er grogenn ER, ha n'eus ket ezhomm eus un tuta Lst1 resis. Neuze, hon eus ergerzhet ar c'halloud e c'hallfe hirder chadenn ar c'heramid er grogenn ER reoliañ liammadur Gas1-GFP ouzh p24. Koulskoude, kavet hon eus ne vez ket efedus bezañs ar c'heramid C18-C16 er grogenn war ar GPI-glikanoù adsavet gant ar c'hemplezh p24 (Skeudennoù S3 ha S4, A ha B) pe stagañ ouzh GPI-AP hag ezporzhiañ GPI-AP. gouestoni. Lakaat an isrummad COPII Lst1 (Skeudenn S4C). Dre-se, ar c'hlusteriñ diouzh ar c'heramid C26 n'eo ket ret kaout etregweredoù protein gant mekanikoù protein ezporzhiañ ER disheñvel, met skoazellañ a ra ur mekanik renkañ all renet gant hirder al lipidoù. Neuze, hon eus dielfennet hag-eñ eo pouezus hirder chadenn asil ar c'heramid er grogenn ER evit renkadur efedus Gas1-GFP evel ERES diuzet. Dre ma kuita Gas1 ar spesad GhLag1 gant ceramid chadenn berr an ER hag e ya e-barzh ar grogenn plasma (Skeudenn S5), e kredomp ma vez kaset ar renkadur gant hirder chadenn asil ar ceramid e c'hall ar Gas1 er strollad GhLag1 bezañ adkaset ha treuzet. marc'hadourezhioù ERES gant ar memes grogenn.
(A) En emgann kelligel GhLag1 e kaver dreist-holl ceramidoù C18-C16 berroc'h, tra ma'z eus c'hoazh gant an eor GPI Gas1-GFP ar memes IPC C26 hag ar c'helligoù a seurt gouez. A-us : dielfennadur hirder chadenn asil ar c'heramid e grogenn gelligel ar spesadoù gouez (Wt) ha GhLag1p dre spektrometriezh tolz (MS). Ar roadennoù a zastum dregantad ar c'heramid hollek. Keitat tri arnod dizalc'h. Barrenn fazi = SD. Test t div-skourr hep par. **** P ＜0.0001. Panell izelañ : dielfennadur MS eus hirder chadenn asil an IPC a gaver en eor GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) eztaolet er spesadoù gouez ha GhLag1p. Ar roadennoù a zastum dregantad ar sinal IPC hollek. Keitat pemp arnod dizalc'h. Barrenn fazi = SD. Test t div-skourr hep par. ns, n'eo ket pouezus. P = 0,9134. (B) Mikrografoù fluoresañs eus kelligoù sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ha sec31-1lst1Δ a eztaol Gas1-GFP broudet gant galaktoz a voe enkubet da 37°C e-pad 30 munutenn ha digreskiñ ar fluoresañs mikroskopiezh goude 24°C. Saezh gwenn : strollad ER Gas1-GFP. Saezh digor : Gas1-GFP hep strollañ a zo skignet war ar grogenn ER a-bezh, o tiskouez livadur ar c'helc'h nukleel a denn d'an ER. Barrenn skeul, 5μm. (C) Kementadur ar fotomikrograf deskrivet e (B). Ar c'hresk keitat a gelligoù gant ur framm Gas1-GFP poentet. E teir arnod dizalc'h, n≥300 kellig. Barrenn fazi = SD. Test t div-skourr hep par. **** P ＜0.0001.
Evit diskoulmañ ar gudenn-mañ war-eeun hon eus graet ur gweledva SCLIM eus Gas1-GFP ha Mid2-iRFP e GhLag1 gant an allel mutant kizidik ouzh an temperadur sec31-1 (Skeudenn 4 ha Film S4). Goude ma oa bet dalc'het an ER da 37°C ha digoret da 24°C da c'houde, ne oa ket bet strollet ha skignet an darn vrasañ eus ar Gas1-GFP nevez-sintezet dre ar grogenn ER, evel ma oa bet gwelet gant mikroskopoù hengounel (Skeudenn 4, A ha B ). Ouzhpenn-se, ur c'hresk bras eus an ERES (67%) a endalc'h daou seurt karg lec'hiet ennañ (Skeudenn 4D). Ar panelloù 1 ha 2 eus ar skeudenn 4C a ziskouez daou skouer stank eus ERES gant Gas1-GFP ha Mid2-GFP a-gevret. Ouzhpenn-se e oa bet dedennet an daou varc'hadourezh er memes ERES (Skeudenn 4E, panell 3 ha film S4). Dre-se e tiskouez hor disoc'hoù eo hirder chadenn asil ar c'heramid e-barzh ar grogenn ER un elfenn bouezus evit an agregadur hag ar renkadur protein ER.
Kelligoù Sec31-1 GhLag1 a eztaol sekredoù degaset gant ar galaktoz, Gas1-GFP (GPI-AP, glas) ha Mid2-iRFP (TMP, glas) ha Sec13-mCherry merket gant ERES (ERES, magenta) a vez goret da 37°C. Kenderc'hel e-pad 30 munutenn, digreskiñ da 24°C evit skarzhañ ar sekredoù, ha skeudenniñ gant SCLIM goude 20 munutenn. (A da C) Skeudennoù rakwelet 2D arouezius (A; barrenn skeul, 1μm) pe skeudennoù hantervoul kelligel 3D (B ha C; unanenn skeul, 0,45μm) eus an 10 z-rann merket gant karg hag ERES. Ar banell izelañ e (B) hag ar banell e (C) a ziskouez skeudennoù treuzfurmet evit diskouez nemet ar madoù a gaver en ERES (magent) [Gas1-GFP (gris) ha Mid2-iRFP (glas sklaer)]. (C) Saezh leuniet gwenn : ERES, marc'hadourezh a dreuzkas. Saezh digor : un elfenn hepken a endalc'h ERES. Panell izelañ : An ERES dibabet en deus marc'hadourezhioù a-gevret (1 ha 2) merket e (C). Barrenn ar skeul, 100 nm. (D) Kementadur ar fotomikrograf deskrivet e (C). En unanennoù GhLag1 sec31-1 ha sec31-1 n'eus nemet ur c'harg (Gas1-GFP pe Mid2-iRFP) a zo enni, hag ar c'hresk keitat a ERES evit ar c'hargoù digenvez hag ar c'hargoù a-gevret. E teir arnod dizalc'h, n = 432 e 54 kellig (sec31-1) ha n = 430 e 47 kellig (sec31-1 GhLag1). Barrenn fazi = SD. Test t div-skourr hep par. *** P = 0,0002 (sec31-1) ha ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Skeudenn 3D eus ERES dibabet gant kargoù a-gevret (3) merket e (C). Gas1-GFP (gwer) ha Mid2-iRFP (glas) a dosta ouzh ERES (magent) diouzh an hevelep tu hag a chom er memes tachenn strishaet ERES. Barrenn ar skeul, 100 nm.
Ar studiadenn-mañ a ginnig testenioù reizh in vivo e vez renket ar c'hargoù protein diazezet war al lipidoù e lec'hioù ezporzhiañ diuzet en hent sekretour, hag a ziskouez pouez hirder ar chadenn asil evit dibab ar renkadur. Gant un teknik mikroskopiezh galloudus ha dibar anvet SCLIM, hon eus diskouezet ar Gas1-GFP nevez-sintezet (ur GPI-AP bras eus ar grogenn plasma gant ul lodenn lipidel ceramide chadenn asil (C26) hir-kenañ) er goell) Ar rannvroioù strollet en ERoù distag a zo kevredet gant ERES spesadel, tra ma vez skignet proteinoù dre ar membranenn dre ar membranenn ERRES (Skeudenn 1). Ouzhpenn-se, an daou seurt madoù-se a ya e-barzh ERESoù disheñvel dre zibab (Skeudenn 2). Digreskiñ a ra hirder chadenn asil ar c'heramid kelligel er grogenn eus C26 da C18-C16, torret eo ar strollad Gas1-GFP er rannvro ER distag, ha kaset eo Gas1-GFP da guitaat an ER gant ar protein treuzgrogenn dre ar memes ERES (Skeudenn 3 ha Skeudenn 3). 4).
Daoust ma implij GPI-AP ur mekanik protein arbennikaet evit mont er-maez eus an ER, hon eus kavet ne vez ket diazezet an disparti diouzh ar c'heramid C26 war etregweredoù protein disheñvel a c'hellfe kas d'arbennikaat ERES (Skeudennoù S4 ha S5). E plas, hon disoc'hoù a skoazell ur mekanik rummatadur all kaset war-raok gant strollañ proteinoù diazezet war al lipidoù hag an eztaoladur da-heul eus kargoù all. Diskouez a ra hon evezhiadennoù n'eus ket eus ar protein Mid2-iRFP sekretet dre dreuzmembran er rannvro pe er strollad Gas1-GFP liammet ouzh un ERES resis, ar pezh a ziskouez e vo aesaet gant ar strollad GPI-AP diouzh ar c'heramid C26 o mont e-barzh an ERES a-bouez, hag er memes koulz e vo skarzhet an dreuzmembran. Er c'hontrol, bezañs ceramidoù C18-C16 e-barzh ar grogenn ER ne laka ket GPI-AP da sevel rannvroioù pe strolladoù, setu ne ziverkont ket pe ne erlec'hiont ket ar proteinoù skarzhet dre ar membranenn er memes ERES (Skeudennoù 3 ha 4). . Dre-se e kinnigomp e vez kaset ar c'heramid C26 war-raok gant an disparti hag ar renkadur dre aesaat strollañ ar proteinoù liammet ouzh ERES resis.
Penaos tizhout ar strollañ-se diouzh ar c'heramid C26 en un dachenn ER resis ? Tud ar c'heramid membran da zispartiañ a-gostez a c'hell lakaat ar c'heramid GPI-AP ha C26 da grouiñ lipidoù bihan hag urzhiet diouzhtu en endro lipidek direizhoc'h ar grogenn ER ennañ gliserolipidoù berroc'h ha dic'hortoz. Strolladoù kalite (17, 18). Ar strolladoù bihan amzerel-se a c'hell bezañ kendeuzet muioc'h c'hoazh e strolladoù brasoc'h ha stabiloc'h goude bezañ staget ouzh ar c'hemplezh p24 (34). Heñvel ouzh se, hon eus diskouezet e rank C26 Gas1-GFP etregwerediñ gant ar c'hemplezh p24 evit sevel strolladoù gwelus brasoc'h (Skeudenn 3). Un oligomer heterozigotek eo ar c'hemplezh p24 savet diwar pevar protein treuzmembranek p24 disheñvel er goell (35), a ginnig ul liamm liesvalent, ar pezh a c'hell kas da liammañ kroaziet strolladoù bihan GPI-AP, o krouiñ dre-se ur strollad stabil brasoc'h (34). An etregwered etre ektodomanioù protein ar GPI-APoù a c'hellfe ivez kemer perzh en o agregadur, evel m'eo diskouezet e-pad o treuzdougen Golgi e kelligoù epitelian polarizet ar bronneged (36). Koulskoude, pa vez ar c'heramid C18-C16 e-barzh ar grogenn ER, pa vez liammet ar c'hemplezh p24 ouzh Gas1-GFP, ne vo ket savet strolladoù bras distag. Ar mekanik diazez a c'hell bezañ diouzh perzhioù fizikel ha kimiek resis ar c'heramid chadenn asil hir. Studioù biofizikel war ar c'horreennoù artifisiel a ziskouez daoust ma c'hall ar c'heramidoù chadenn asil hir (C24) ha berr (C18-C16) lakaat an disparti fazennoù da dalvezout, met n'eus nemet ar c'heramidoù chadenn asil hir (C24) a c'hell broudañ ur c'hrommenn uhel hag ur plegañ film evit adkempenn ar film. Dre evezhiadennoù etrezo (17, 37, 38). Diskouezet eo bet e vez etregwelet dre zibab an heliks treuzmembranek eus TMED2, an homolog denel eus Emp24, gant ar sfingomielin diazezet war ar c'heramid C18 el lobulennoù sitoplazmek (39). Dre implijout simuladurioù an dinamik molekulel (MD) hon eus kavet e vez dastumet ar c'heramidoù C18 ha C26 tro-dro da lobuloù sitoplazmek an heliks treuzmembranek Emp24, hag o deus gwellvezioù heñvel (Skeudenn S6). Ret eo merkañ e tiskouez kement-se e c'hall an heliks treuzmembranek eus Emp24 kas da zasparzh direizh al lipidoù er grogenn. Un disoc'h nevez eo, diazezet war kelligoù ar bronneged. Simuladurioù MD heñvel a ziskouez ivez bezañs lipidoù eter (40) . Dre-se e soñjomp eo pinvidikaet lec'hel ar c'heramid C26 en daou lobul ER26. Pa vez staget GPI-AP el lobulennoù luminel war-eeun ouzh p24 liesvalentek ha pa vez dastumet ceramide C26 tro-dro da p24 el lobulennoù sitoplazmek, e c'hall broudañ an agregadur proteinoù a-gevret hag ar c'hrommenn membran a vez krouet dre ar bizied (41), o lakaat GPI-AP da zispartiañ e rannvroioù distag e-kichen ERES, hag a faot ivez d'ar rannvroioù krommennoù uhel ar grogenn ER (42). Danevelloù kent a skoazelle ar mekanik kinniget (43, 44). Liammañ liesvalentez an oligolektinoù, ar patogenoù pe an enepkorfoù ouzh ar glikosfingolipidoù diazezet war ar c'heramid (GSL) war ar grogenn plasma a laka da greskiñ un agregadur GSL bras, a gresk an disparti fazennoù hag a laka ar grogenn da zistrujañ ha da vezañ diabarzhet (44). Iwabuchi hag all. (43) Kavet e oa bet e oa, pa oa chadennadoù asil hir (C24) met n'int ket berr (C16), e oa bet broudet gant al ligand liesvalentek stag ouzh laktosilkeramid GSL stummañ strolladoù bras hag enframmadur ar grogenn, hag an treuzkas sinal Lyn-mediaet war ar follennoù a oa bet etrekaset gant chadennoù neutrofil e-barzh ur c'houblad neutrofiloù.
E kelligoù epiteliel polarizet ar bronneged e vez kontrollet disparti ha renkadur GPI-AP gant ar c'hresk eus ar rouedad enep-Golgi (TGN) betek live ar grogenn plasma apikel (10, 45). An agregadur-se a zo kaset gant an oligomerizadur GPI-AP (36), met gallout a ra ivez diouzh hirder chadenn ar c'heramid a gaver er goell. Daoust ma'z eus gant GPI-AP ar bronneged un eor diazezet war lipidoù eter, ha ma'z eo disheñvel-tre e framm kimiek diouzh ar c'heramid chadenn asil hir-kenañ, ez eus bet kavet gant ur studiadenn nevez zo e oa gant an daou lipid perzhioù ha fonksionoù fizikel ha kimiek heñvel a-fet emdroadur (40). Dre-se e c'hallfe al lodenn lipid eter e kelligoù ar bronneged bezañ heñvel ouzh ar c'heramid C26 er goell, hag e roll eo kevreañ gant ar c'heramid chadenn hir er grogenn evit brudañ an agregadur hag ar renkañ GPI-AP. Daoust ma ranker amprouiñ ar c'hementad-se war-eeun c'hoazh, e tiskouez ar pezh a zo bet kavet a-raok ne vez ket kaset da benn treuzdougen ar c'heramid chadenn asil hir betek korf Golgi gant proteinoù treuzkas sitoplazmek, met diouzh sintezenn ankoù GPI evel ar goell. Dre-se e seblant ar mekanik mirour emdroadurel bezañ gouest da gevreañ en un doare diuzet ceramid chadenn asil hir-tre ha GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) er memes vesikel treuzdougen.
E reizhiadoù kelligoù epitelian polarizet ar goell hag ar bronneged e c'hoarvez an agregadur GPI-AP hag an disparti diouzh proteinoù all ar grogenn plasma a-raok tizhout gorre ar gellig. Paladino hag all. (48) a gavas war TGN ar c'helligoù epitelian polarizet ar bronneged, n'eo ket ret ar c'hlusteriñ GPI-AP evit renkañ diuzet ar GPI-APoù d'ar grogenn plasma apikel hepken, met ivez evit reoliñ aozadur strollañ ar GPI-APoù hag o obererezh biologel. Gorre ar gellig. Er goell, ar studiadenn-mañ en deus diskouezet e c'hall ar strollad GPI-AP diouzh ar c'heramid C26 war an ER reoliañ aozadur ar strollad hag obererezh fonksionel GPI-AP war ar grogenn plasma (24, 49). Heñvel ouzh ar patrom-mañ, ar c'helligoù GhLag1 a zo alergiek ouzh an harperien GPI pe ouzh ar medisined a lak da dalvezout integritezh ar pared kelligel (28), hag an ezhomm da gaout strolladoù Gas1-GFP fonksionel (49) eus ar c'heramid penn rakwelet e pareañ ar c'helligoù goell a ziskouez G� Heuliadoù fiziologel posupl eus ar c'helligoù hLag1. Fazi GPI-AP. Koulskoude, testiñ muioc'h hag-eñ eo bet programmet aozadur fonksionel gorre ar c'helligoù diwar an ER dre un doare renkañ diazezet war hirder al lipidoù a vo danvez hon enklaskoù da zont.
Ar spesadoù Saccharomyces cerevisiae implijet el labour-mañ a zo meneget e taolenn S1. Savet e oa bet ar spesadoù MMY1583 ha MMY1635 eus SCLIM evit skeudenniñ kelligoù bev e foñs W303. Ar spesadoù-se a eztaol Sec13-mCherry gant un dikedenn protein fluoresket a oa bet savet dre implijout un doare diazezet war ar reaktadur enkadenn polimeraz (PCR) gant ur plasmid pFA6a evel patrom (23). Ar spesad a eztaol Mid2-iRFP merket gant protein fluoreskant dindan kontroll ar bromesaer GAL1 a oa bet savet evel-henn. Kreñvaat dre PCR an heuliad iRFP-KanMx diwar ar vektor pKTiRFP-KAN (prof E. O'Shea, niverenn blazmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; anavezer ar binvioù enklask (RRID): Addgene_64687) Hag enlakaet e-barzh an dibenn-dibenn C22. Goude ma oa bet kreñvaet ha klonet an heuliad genom Mid2-iRFP e-barzh ar promoter GAL1 e oa bet enkorfet e lec'hienn Not I-Sac I ar plasmid enframmañ pRS306. Ar plasmid pRGS7 a zeuas war wel a voe linennet gant Pst I evit enframmañ el lec'h URA3.
Ar gen kendeuziñ Gas1-GFP a vez eztaolet dindan kontroll ar bromesaer GAL1 er plasmid kreizmer (CEN), a zo savet evel-henn. Kreñvaet e voe an heuliad Gas1-GFP dre PCR diwar ar plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (prof L. Popolo) ha klonet e lec'hienn Xma I–Xho I ar plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (prof C) . Miller; Niverenn plasmid adgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Adgene_51225). Anvet eo bet ar plasmid pRGS6. Ar gen kendeuziñ Axl2-GFP a vez eztaolet ivez dindan kontroll ar bromesaer GAL1 eus ar vektor pBEVY-GL LEU2, hag e sevel a zo evel-henn. Kreñvaet eo bet an heuliad Axl2-GFP diwar plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) dre PCR, ha klonet e lec'hienn Bam HI-Pst I ar vektor pBEVY-GL LEU2. Anvet eo bet ar plasmid pRGS12. Heuliad an oligonukleotidoù implijet er studiadenn-mañ a zo meneget e taolenn S2.
Ouzhpennet e oa bet ar spesad gant 0,2% adenin ha 2% glukoz [YP-dekstroz (YPD)], 2% rafinoz [YP-rafinoz] pinvidik gant protein p (YP) (1 % tennañ goell ha 2% protein ept). (YPR)] pe 2% galaktoz [YP-galaktoz (YPG)] evel font karbon, pe en ur metou minimal sintetek (0,15% diazez nitrogen goell ha 0,5% sulfat amoniom) evit ouzhpennañ an asidoù amino hag ar bazennoù dereat a vez ezhomm evit ar boued, hag enni 2% glukoz (medium glukotek) pe 2% glukoz minimal galaktoz (galaktoz minimal sintetek) evel font karbon.
Evit ar skeudenniñ e-pad an amzer gwirion e voe kresket kelligoù mutant sec31-1 kizidik ouzh an temperadur hag a eztaol ar savadur dindan ar promoter GAL1 e-barzh ur meziant YPR da 24°C e-pad an noz betek ar prantad kreiz-log. Goude bezañ bet enframmet e YPG da 24°C e-pad 1 eurvezh e voe goret ar c'helligoù e SG da 37°C e-pad 30 munutenn, ha goude-se e voe treuzkaset da 24°C evit o lezel da vont kuit eus ar bloc'h sekred. Implijet e oa bet Concanavalin A evit stagañ ar c'helligoù war ur bladenn gwer ha skeudennaouet gant SCLIM. SCLIM zo ur meskaj etre ur mikroskop fluoresañs troet Olympus IX-71 hag al liñsel eoul digor niverel UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), ur skanner kenfokal pladennoù troet tizh uhel ha gant ur c'heñver sinal-trouz uhel (Yokogawa Electric), ur spektrometr personelaet, ar reizhiadoù skeudennaouiñ kreñvaat ha skeudennoù kreñvaat (Hamamatsu Photonics) a c'hell pourchas ur reizhiad liñselioù gant ur brasadur diwezhañ a ×266,7 hag ur c'hamera karg-kouplet a lieskement an elektronoù (Hamamatsu Photonics) (21). Graet e vez an adtapout skeudennoù gant ur meziant personelaet (Yokogawa Electric). Evit ar skeudennoù 3D hon eus implijet un oberataer piezoelektrek savet war-eeun evit lakaat al liñsel da grenañ war-eeun, ha dastumet hon eus al lodennoù optikel 100 nm an eil diouzh egile en ur bern. Treuzfurmet eo ar skeudenn Z-stack e roadennoù voxel 3D, hag ar fonksion skignañ poentoù damkanel implijet evit ar mikroskop kenfokal disk troet a vez implijet evit an tretañ dic'honvolusion gant ar meziant Volocity (PerkinElmer). Dre implijout ar meziant Volocity evit termeniñ ent emgefre an dielfennadur kenlec'hiañ e oa bet muzuliet an ERES en o zouez ar c'hargoù. Graet e oa bet an analizenn skaniñ linennoù gant ar meziant MetaMorph (Molecular Devices).
Implijit ar meziant GraphPad Prism evit termeniñ ar ster stadegel. Evit an t-test Student div-skourr hag an test an analizenn diforc'hioù un tu ordinal (ANOVA) e vez sellet ouzh an diforc'hioù etre ar strolladoù evel ouzh un efed pouezus war P <0,05 (*).
Evit ar mikroskopiezh fluoresañs Gas1-GFP e voe kresket ar c'helligoù fazenn log e-pad an noz e YPD ha dastumet dre greizennañ, gwalc'het div wech gant holen tamponet gant fosfat, ha goret war skorn e-pad 15 munutenn da nebeutañ, ha goude-se e voe kaset da benn dindan ar mikroskop evel deskrivet a-raok Check (24). Implijet e oa bet ar mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 eoul PH3 CS) gant ul liñsel objektivel, ur sil L5 (GFP), ur c'hamera Hamamatsu hag ur meziant Application Suite X (LAS X) evit an adtapout. .
Denaturet e voe ar skouerennoù gant ur skouerenn SDS da 65°C e-pad 10 munutenn, ha goude-se e voent dispartiet dre elektroforezenn gel SDS-poliakrilamid (PAGE). Evit an dielfennadur immunoblotting e voe karget 10 μl a skouerennoù dre hent. Enepkorf pennañ : Implijit anti-Gas1 liesklonel ar c'honikl gant un diluziadur a 1:3000, un enep-Emp24 liesklonel gant ur c'honikl gant un diluziadur a 1:500, hag un enep-GFP liesklonel gant ar c'honikl (ur prof digant H. Riezman) gant un diluziadur a 1:3000. Implijet e oa bet an enepkorf monoklonel anti-Pgk1 gant un diluziadur a 1:5000 (ur prof digant J. de la Cruz). Enepkorf eilrenk : immunoglobulin G (IgG) enep-konikl kevredet gant peroksidaz ar c'hregin (HRP) implijet gant un diluziadur a 1:3000 (Pierce). Implijet e oa bet IgG enep-logodenn givr kenstaget gant HRP gant un diluziadur a 1:3000 (Pierce). Ar rannvro respont difenn a oa bet sellet outañ dre an doare kimielluminezenn eus ar reagent SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Evel deskrivet e (31), un arnod immunopresipitadur naturel a oa bet kaset da benn war ar fraksion ER pinvidikaet. E berr gomzoù, gwalc'hit ar c'helligoù goell gant ur buffer TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fluorid fenilsulfonil ha meskaj harzoù proteaz) da 600 nm ( OD600) da 100 stankter optikel div wech. Torret e oa bet gant perlez gwer, ha goude-se e oa bet tennet an dilerc'hioù kelligoù hag ar perlez gwer dre greizennañ. Neuze e voe kreizennet ar surnatant da 17 000 g e-pad 15 munutenn da 4°C. Adlakaet e voe ar pellet en TNE ha saponin digitalis a voe ouzhpennet betek ur c'hementad diwezhañ a 1%. Goret e voe ar skorn e-pad 1 eurvezh gant troidigezh da 4°C, ha goude-se e voe tennet ar c'hementadoù dizoloet dre greizennañ da 13 000 g da 4°C e-pad 60 munutenn. Evit an immunopresipitadur Gas1-GFP, da gentañ e vez rak-enkubet ar skouerenn gant perlez agaroz goullo (ChromoTek) da 4°C e-pad 1 eurvezh, ha goude-se e vez enkubet gant GFP-Trap_A (ChromoTek) da 4°C e-pad 3 eurvezh. Gwalc'het e voe ar perlez immunopresipitaet pemp gwech gant TNE ennañ 0,2% digoksigenin, eluet gant tampenn skouerennoù SDS, dispartiet war SDS-PAGE, ha dielfennet dre immunoblotting.
Evel deskrivet e (31), e oa bet graet an termenadur dre liammañ war ar fraksion ER pinvidikaet. E berr gomzoù, ar fraksion ER pinvidikaet a oa bet goret gant 0,5 mM dithiobis (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, SUA; 20°C, 20 mn). Lazhet e voe ar reaktadur liammañ dre ouzhpennañ glisin (50 mM a zarempred diwezhañ, 5 munutenn, 20°C).
Evel deskrivet a-raok (50), e oa bet graet un dielfennadur MS eus ar c'heramid e spesadoù gouez ha GhLag1. E berr gomzoù, ar c'helligoù a oa bet kresket betek ar prantad eksponentiel (3 da 4 unanenn OD600/ml) e YPD da 30°C, ha 25×107 kellig a oa bet dastumet. Lazhet e vez o metabolism gant trenkenn tricloroasetek. Implijit dizoloer tennañ [etanol, dour, eter, piridin ha 4,2 N hidroksid amoniom (15:15:5:1:0,018 v/v)] ha 1,2 nmol a c'halloud ceramid C17 standard diabarzh (860517, lipid polar Avanti)). Implijit ar reagent monometilamin [metanol, dour, n-butanol ha disoc'h metilamin (4:3:1:5 v/v)] evit ober un hidrolizenn alkaliek dous eus an eztennañ, ha goude-se implijit n-butanol sañset gant dour evit disholañ. A-benn ar fin e voe adstaget an tennadenn en un dizoloer mod pozitivel [kloroform/metanol/dour (2:7:1) + 5 mM asetat amoniom] hag enlakaet e voe er spektrometr tolz. Graet e oa bet ar surentez liesreaksion (MRM) evit anavezout ha muzuliañ ar molekulennoù sfingolipid. Ar spektrometr tolz pevarpol trede derez TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) a zo pourvezet gant ur font ionoù nanofluenn robotek Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) evit an analizañ lipidoù. An energiezh stokañ a zo gwellaet evit pep rummad keramid. Roadennoù MS a oa bet tapet e mod pozitivel. Evit pep eiladenn vevoniel eo ar sinal lipid ar c'hreiz eus teir muzuliadenn dizalc'h.
Evel deskrivet e (31), ar c'helligoù (800×107) a eztaol Gas1-GFP a oa bet lakaet dindan un immunopresipitadur naturel. Dispartiet e voe ar Gas1-GFP puraet dre SDS-PAGE ha treuzkaset d'ur grogenn fluor poliviniliden (PVDF). Gwelet e oa bet ar protein dre livañ PVDF gant amid du. Troc'het e oa bet ar vandenn Gas1-GFP diouzh ar PVDF ha gwalc'het 5 gwech gant metanol hag ur wech gant dour live kromatografiezh liñvel-MS (LC-MS). Dre enkubañ ar vandenn grogenn gant 500μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), tampon ha 500μl meskaj nitrit sodiom 1 M nevez-dizoloet da 37°C e-pad 3 eurvezh, e vez skarzhet ar fraksion lipidek eus Gas1-GFP ha lizet e vez skarzhet an infoosinfosoin e-barzh ar c'heraminaoled hag ar c'heramit (51). Goude-se e voe gwalc'het ar vandenn grogenn pevar gwech gant dour LC-MS, sec'het e temperadur ar gambr, ha miret en un aergelc'h nitrogen da -80°C betek an analizañ. Evel kontroll e voe implijet ur skouerenn goullo eus ar grogenn PVDF evit pep arnod. Ar lipid tennet eus Gas1-GFP a voe dielfennet neuze gant MS evel deskrivet (50). E berr gomzoù, bannoù PVDF enno GPI-lipid a voe adlakaet e 75μl dizoloer moull negativel [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM asetat amoniom] ha tremenet dre ionizadur elektrospray (ESI)-MRM/MS Analysis of sphingolipid species (TSQ Vantage). Er c'has-mañ e oa bet tapet roadennoù MS e mod ionoù negativel.
Evel meneget a-raok, e oa bet dispartiet lodenn lipidel an eor GPI diouzh ar GPI-AP merket gant [3H]-inositol (16). Dispartiet e voe al lipidoù dre gromatografiezh dre gwiskadoù tanav gant ur reizhiad dizoloer (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) ha gwelet gant FLA-7000 (Fujifilm).
Ar c'helligoù a eztaol Gas1-GFP (600×107) a voe gwalc'het div wech gant tampon TNE gant tampon TNE, ha torret gant perlez gwer, ha goude-se e voe greizennet evit tennañ an dilerc'hioù kelligoù hag ar perlez gwer. Neuze e voe kreizennet ar surnatant da 17 000 g e-pad 1 eurvezh da 4°C. Gwalc'het e voe ar pellet e TNE ha goret gant 1 U PI-PLC (Invitrogen) e TNE ennañ 0,2% saponin digitalis e-pad 1 eurvezh da 37°C. Goude an tretañ dre enzim e voe tennet ar grogenn dre greizennañ da 17 000 g da 4°C e-pad 1 eurvezh. Evit immunopresipitañ Gas1-GFP e voe goret ar surnatant gant GFP-Trap_A (ChromoTek) da 4°C e-pad an noz. Ar Gas1-GFP puraet dispartiet gant SDS-PAGE a oa bet livet gant glas skedus Coomassie. Troc'het e voe ar vandenn livañ Gas1-GFP diouzh ar griz tro-dro d'an dour-dour, ha goude-se goude alkiladur gant iodoasetamid ha digreskiñ gant ditiotreitol e voe graet un digeriñ e-barzh ar gel gant tripsin. Tennañ ha sec'hañ peptidoù triptek ha peptidoù gant GPI-glikanoù. Ar peptid sec'h a voe teuzet e 20 μl dour. Enlakaat ul lodenn (8μl) er LC. Ur bann octadecylsilan (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; treuzkiz diabarzh 150 mm×1,0 mm; Nomura Chemical, Prefeti Aichi, Japan) a voe implijet evit dispartiañ ar peptidoù dindan stadoù gradient resis. Ar fazenn fiñvus eo an dizoloer A (0,08% asid formek) hag an dizoloer B (0,15% asid formek e 80% asetonitril). Ur reizhiad Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) a voe implijet evit eluiñ ar bann gant dizoloer A e-barzh 55 munutenn gant ur feur red a 50 μl min-1 e-pad 5 munutenn, ha goude-se e voe kresket ar c'hementad dizoloer B da 40%. , Stadoù-Unanet). An eluat a oa bet lakaet e-barzh ar font ionoù ESI en un doare kendalc'hus, hag ar peptidoù triptek hag ar peptidoù gant GPI-glikanoù a oa bet dielfennet gant LTQ Orbitrap XL (spektrometr tolz trap-orbitrap ionoù linennek hiron; Thermo Fisher Scientific). Er staliadur MS e oa bet lakaet voltadur ar font kapiler da 4,5 kV, ha miret e oa bet temperadur ar c'hapiler treuzkas da 300°C. Lakaet e oa bet ar voltadur kapiler hag ar voltadur al liñsel tubenn da 15 V ha 50 V, hervez an urzh. Roadennoù MS a oa bet tapet er mod ionoù pozitivel (disoc'h 60 000; resisted tolz 10 lodenn dre vilion) en ur rann tolz a 300/m/z feur tolz/karg (m/z) 3000. Ar roadennoù MS/MS a zo bet tapet dre an trap ionoù en Orbit LTQ [3] a zalc'h ar roadennoù da gentañ distagadur degaset gant ar stokadenn (CID)].
Graet e oa bet ar simuladurioù MD gant ar meziant GROMACS (52) hag an dachenn nerzh MARTINI 2 (53-55). Implijet e voe neuze ar CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) evit sevel ur divskouerenn ennañ dioleoilfosfatidilkolin (DOPC) ha Cer C18 pe DOPC ha Cer C26. Tennet eo topologiezh ha kenurzhiennoù Cer C26 eus DXCE dre lemel ar perlez ouzhpenn eus lost ar sfingozin. Implijit an argerzh deskrivet amañ dindan evit kempouezañ ar gwiskad doubl ha kas anezhañ da benn, ha goude-se implijit kenurzhiennoù diwezhañ ar reizhiad evit sevel ur reizhiad ennañ Emp24. Savet e oa bet domani treuzmembranek ar goell Emp24 (restachoù 173 da 193) evel un α-heliks dre implijout ar framm molekulel ostilh MD gwelet (VMD) (58). Neuze, goude bezañ tennet al lipidoù a-gevret, e voe greunet gros ar protein ha lakaet e-barzh an divc'horn dre implijout CHARMM GUI. Er reizhiad diwezhañ e kaver 1202 DOPC ha 302 Cer C26 pe 1197 DOPC ha 295 Cer C18 hag Emp24. Ionizañ ar reizhiad betek ur c'hementad a 0,150M. Pevar eiladenn dizalc'h a oa bet graet evit daou genaozadur divskoaz.
Kempouezet e vez ar c'heflusker lipidek dre implijout an argerzh CHARMM GUI, a dalvez da zigreskiñ ha da gempouezañ 405 000 pazenn, ma vez digresket ha diverket tamm-ha-tamm ar strishadurioù lec'hiadur, ha ma vez kresket ar pazenn amzer eus 0,005 ps da 0,02 ps. Goude an eilpennañ e vez produet 6 μs gant ur pazenn amzer a 0,02 ps. Goude bezañ ensoc'het Emp24, implijit ar memes argerzh CHARMM GUI evit digreskiñ ha kempenn ar reizhiad, ha goude-se mont e-pad 8 eilenn er produiñ.
Evit an holl reizhiadoù, e-pad an argerzh kempouezañ, e vez kontrollet ar gwask gant barostad Berendsen (59), hag e-pad an argerzh produiñ e vez kontrollet ar gwask gant barostad Parrinello-Rahman (60). En holl degouezhioù eo 1 bar ar gwask keitat hag implijet e vez ur reizhiad kevreañ gwask hanter-izotropek. E-kerzh ar c'hempouez hag ar produiñ e vez implijet un termostat (61) gant adkalibradur tizh evit liammañ temperadur ar rannigoù protein, lipid ha dizoloer hervez o urzh. E-pad an oberiadenn a-bezh eo 310K an temperadur pal. An etregwered nann-stagañ a vez jedet dre sevel ur roll pareañ dre implijout ar skeul Verlet gant 0,005 gouzañv tampon. Termen Coulomb a vez jedet dre implijout an dachenn reaktadur hag ur pellder troc'h a 1,1 nm. An termen Vander Waals a implij ur skeul troc'hañ gant ur pellder troc'hañ a 1,1 nm, hag ar skeul troc'hañ Verlet a vez implijet evit an dilec'hiañ a c'hallfe bezañ (62).
Gant VMD eo 0,7 nm an hirder gwagenn etre ar perlez fosfat DOPC pe ar perlez ceramide AM1 hag ar protein, ha jedet e vez an niver a lipidoù a etregwered gant ar protein. Hervez ar formulenn da-heul, jediñ ar faktor digreskiñ-pinvidikaat (DE) evel e (63) : faktor DE = (ar c'hementad lipidoù hollek er protein 0,7) er protein 0,7 (ar c'hementad Cer er c'hementad lipidoù hollek)
Ar werzh embannet a vez tapet evel keitat, hag ar barrennoù fazi a zo pevar eiladenn dizalc'h eus SE. Ar ster stadegel eus ar faktor DE a vez jedet dre an test t [(averageDE-factor-1)/SE]. Jediñ ar werzh P diwar an dasparzh unvan.
Implijet e oa bet an ostilh GROMACS evit jediñ kartenn stankter 2D ar reizhiad ennañ Emp24 e-kerzh 250 ns diwezhañ an heuliad. Evit kaout kartenn pinvidikaat/digreskiñ ar c'heramid e vez rannet kartenn stankter Cer gant sammad kartenn Cer ha DOPC, ha goude-se rannet gant kresk Cer er c'horf. Implijet e vez ar memes skeul kartenn livioù.
Evit kaout dafar ouzhpenn evit ar pennad-mañ, kit da welet http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ur pennad digor eo, skignet dindan termenoù an aotre-implijout Creative Commons Attribution-Non-Commercial, hag a aotre an implij, an dasparzh hag an adkempenn e forzh peseurt meziant, keit ha ma n'eo ket evit gounid armerzhel an implij diwezhañ ha ma'z eo reizh al labour orin. Dave.
Evezhiadenn : Goulenn a reomp diganeoc'h reiñ ho chomlec'h postel nemet evit ma ouezo an hini a ginnigit war ar bajenn e fell deoc'h e vefe gwelet ar postel gantañ ha n'eo ket spam. Ne vo ket tapet chomlec'h postel ebet ganeomp.
Implijet e vez ar goulenn-mañ evit gwiriañ hag-eñ oc'h ur weladenner ha mirout ouzh an enporzhiañ stroboù ent emgefre.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero Serero), Logaz Lopez (Serhope), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Skeudennaouiñ 3D e amzer wirion gant diarunusted uhel a ziskouez pouez hirder chadenn ar c'heramid evit renkañ ar proteinoù e lec'hioù disoc'h diuzet.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero Serero), Logaz Lopez (Serhope), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Skeudennaouiñ 3D e amzer wirion gant diarunusted uhel a ziskouez pouez hirder chadenn ar c'heramid evit renkañ ar proteinoù e lec'hioù disoc'h diuzet.
©2020 Kevredigezh Amerikan evit Araokaat ar Skiantoù. an holl wirioù miret. AAAS zo ur c'hevread eus HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ha COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.