Trugarez deoc'h da vezañ deuet da weladenniñ Nature.com. Ar stumm merdeer a implijit en deus ur skoazell bevennet evit CSS. Evit kaout ar gwellañ doare, e kinnigomp deoc'h implijout ur merdeer hizivaet (pe diweredekaat ar mod keverlec'hiañ en Internet Explorer). E-keit-se, evit ma vo kendalc'het gant ar skoazell, e vo diskouezet al lec'hienn hep stiloù ha JavaScript.
Er c'hontrol d'ar mellkeineged e soñjer kalz e vank d'an amprevaned hormonoù steroid reizhel a-du gant ar baotred. En Anopheles gambiae e seblant ar steroid ekdison 20-hidroksiekdison (20E) bezañ emdroet evit kontrolliñ diorren an ovoù pa vez sintezet gant ar parezed2 ha evit broudañ ur c'houblad pa vez treuzkaset ar c'henderc'hañ reizhel gant ar vioù 3. ha pareañ a zo perzhioù genel diazez, kompren penaos e vez enframmet ar sinaloù hormonel-se gant ar moc'h Anopheles merc'hed a c'hellfe aesaat sevel programmoù nevez evit kontrollañ ar malaria. Amañ e tiskouezomp e vez reoliet ar fonksionoù genel-se gant steroidoù reizhel disheñvel dre ur rouedad kemplezh a enzimoù a laka an ekdisteroidennoù da vont en-dro/a ziweredekaat. 3-dehydro-20E (3D20E), a warez ar gerent dre serriñ degemer reizhel ar merc'hed goude an treuzkas reizhel hag an aktivadur dre zifosforiladur. Dreist-holl, an treuzkas 3D20E en deus ivez broudet eztaol ar genoù engehentiñ a zalc'h diorren an ovoù e-pad ar c'hleñved Plasmodium, o tiwall yec'hed ar parezed klañv n'eo ket bet lazhet gant EF 20E. respont reizhel, met aotren a ra an hiniennoù o pareañ da lakaat o vioù goude ma vo harzet ar c'hinazoù 20E. Anavezout an hormon steroid amprevaned-se a denn d'ar baotred hag e roll e reoliañ degemer reizhel, frouezhusted hag etregwered ar merc'hed gant Plasmodium a ziskouez e c'hallfe digreskiñ berzh engehentiñ ar moustiked a dreuzkas ar malaria.
Kreskiñ a ra an niver a dud klañv gant ar malaria4 abalamour d'ar resistañs ledan ouzh an amprevaned e-touez ar moustiked Anopheles, ar vektor nemetañ evit ar parazited malaria denel. Ur pal dedennus-kenañ eo biologiezh ar mousc'hoarzhed-se evit an oberoù nevez evit kontrollañ ar malaria rak ne vez pareet ar parezed nemet ur wech5; lakaat an darvoud pareañ-se da vezañ steril a c'hallfe digreskiñ poblañsoù ar moustiked war an dachenn.
Ar merc'hed a zeu da vezañ dic'hallus war an dachenn reizhel goude bezañ resevet hormonoù steroid uhel gant ar baotred. Studioù o deus diskouezet eo ar 20-hidroksiekdizon (20E) an hini a laka an diaesterioù da vezañ pareet pelloc'h, un hormon steroid anavezetoc'h evel ur reoler eus ar c'helc'hiad troc'hañ er mare larvenn. Barregezh ar baotred da sintezenniñ ha da dreuzkas en deus diorroet dreist-holl 20-E Anofeled ul lodenn eus an isgenad Cellia7, a zo skignet en Afrika hag a zo ennañ ar vektoroù dañjerusañ evit ar malaria, en o zouez Anopheles gambiae. Notennet eo dreist-holl rak er spesadoù-se e vez produet 20E gant ar parezed goude pep pred gwad, ha 20E a gas war-raok ar c'helc'hiad oogenez (gwelet ref. 8). ecdysone (treuzkas ar baotred hag induiñ ar magañ gwad) hep lakaat en arvar o galloud da pareañ. E gwirionez, ma laka an 20E produet gant ar parezed da greskiñ an dic'houzañvder reizhel, e vo kaoz eus an difrouezh e-touez an dud a zebr gwerc'hezed, ur c'homporter a-bouez-kenañ er moustiked-se5.
Un displegadenn a c'hellfe bezañ eo e treuzkas ar baotred A. gambiae un ekdison kemmet a denn d'ar baotred, ar pezh a laka da vont en-dro ur c'haskad sinañ en hent engehentiñ ar merc'hed, ar pezh a zegas distabilded ar c'houblad. Koulskoude, daoust ma vez meur a hormon steroid gant ar mellkeineged, evel an estrogen hag an androgen (adwelet e ref. 9), d'hon anaoudegezh, n'eo ket bet anavezet an steroid steroid hag ar steroid en amprevaned.
Kroget hon eus da zivizout roll an hormonoù steroid e gwagrenn skoazell gourel (MAG) an A. gambiae darev war an dachenn reizhel en ur glask steroidoù a c'hallfe bezañ kemmet. Gant ar c'hromatografiezh liñvel a c'hallfe bezañ kemmet gant ar spektrometriezh tolz tandem (HPLC-MS/MS) e-lec'h an doare nebeutoc'h resis implijet a-raok, hon eus detektet an edy (E20) hag an edy (E20)-mañ gwiad, o kadarnaat an disoc'h kent. Koulskoude, ar skouerenn a oa mestroniet gant steroidoù fosforilet oksidet, ar pezh a glot gant ar formulenn 3-dehidro-20E22-fosfat (3D20E22P)12 (Skeudenn 1). Stummoù all a zo 3-dehidro-20E (3D20E22P) ha 20E22-fosfat (20E22P). Daou urzh uheloc'h e oa kreñvder ar sinal HPLC-MS/MS eus 3D20E22P eget e stumm difosforilet, 3D20E, ha teir urzh uheloc'h eget hini E ha 20E (Skeudenn 1). Daoust ma'z eo e lodennoù all eus ar c'horf hag e lodennoù izelañ an engehentiñ (Skeudenn 1; Skeudenn 1). ivez ecdysteroids e pared ha parezed nevez serret (<1 devezh) ha detektet 3D20E ha 3D20E22P e MAG hepken; E, 20E ha 20E22P a oa en daou reizh (Roadennoù astennet Skeudenn 1b). Ar roadennoù-se a ziskouez e vez produet gant ar baotred oad A. gambiae titroù uhel a hormonoù kemm en o MAGoù ha n'int ket sintezet gant ar parezed.
MAG ha LRT merc'hed (en o zouez an atria, ar vezikel seminal hag ar parovariom) a voe disec'het diwar gwazed gwerc'h 4 devezh (4 devezh) ha merc'hed gwerc'h ha pareet (0,5, 3, ha 12 hpm). An ekdison er gwiadoù-se a voe dielfennet dre HPLC-MS/MS/daou-skourr, div-skouerenn hep pajennoù, tpat ± t; feur dizoloadenn faos (FDR) reizhet; *P < 0,05, **P < 0,01 .3D20E : 3 eurvezh e-keñver 0,5 eurvezh, P = 0,035; 3D20E22P: 3 eurvezh e-keñver 0,5 eurvezh, P = 0,25; 12 eurvezh e-keñver 3 eurvezh, P = 0,0032; 12 eurvezh e-keñver 0,5 eurvezh, P = 0,015). Ar roadennoù a zeu eus teir adlavarenn biologel. Ar gorread uhelañ evit pep ecdy a oa bet jedet dre an niver a evezhiadennoù dedennet ar moustiked. An ekdison a vez diskouezet dre liv evel-henn : E, glas ; 20E, orañjez; 20E22P, limestra; 3D20E, glas; 3D20E22P, roz. An ensoc'h a gresk ar skalfad war an ahel y evit diskouez liveoù ekdison izelañ.
Evit gouzout hag-eñ e vez treuzkaset 3D20E22P ha 3D20E e-pad ar c'houblad, hon eus disec'het LRToù merc'hed e poentoù amzer disheñvel goude ar c'houblad. Daoust ma ne oa ket bet kavet ecdysone e-touez ar gwerc'hezed, hon eus gwelet kementadoù bras a 3D20E22P en LRT diouzhtu goude ar c'houblad (05 eurvezh goude ar c'houblad), o tigreskiñ dreist-holl. Kreskiñ a reas kalz liveoù 3D20E (Skeudenn 1). Dre implijout 3D20E sintezet kimiek evel skouer, hon eus termenet e oa liveoù an hormon steroid-se en LRToù pareañ 100 gwech uheloc'h eget 20E da nebeutañ (Taolenn roadennoù astennet 1). Setu, 3D20E22P eo an ecdy gour pennañ a vez treuzkaset d'ar vaouez LRT e-pad an LRT pareañ, hag e stumm difosforilet, 3D20E, a zeu da vezañ kalz a-bouez nebeut amzer goude ar pareañ. Kement-se a ziskouez ur perzh pouezus evit an ekdison diwezhañ e biologiezh ar merc'hed goude ar pareañ.
Goude bezañ krouet ur strollad roadennoù nevez evit heuliañ an ARN (RNA-seq) (Skeudenn 2a), en ur implijout ur stlennvon bioinformatik savet war-eeun, hon eus klasket an ekdizon kinaz (EcK), an ekdizon oksidaz (EO), hag an ekdizon a enrineg ar fosfataz kemmet 20E) a vez eztaolet e gwiadoù engehentiñ. anavezet ur gen EPP kannad ha daou gen EcK a c'hallfe bezañ (EcK1 hag EcK2), met n'int ket bet gouest da gavout ur gen EO kannad mat. Dreist-holl e oa bet eztaolet ar genoù EPP hiniennel e liveoù uhel (98,9vet dregantad) e MAGoù Gambia met n'eo ket e LRToù merc'hed (Skeudenn 2b), er c'hontrol d'ar pezh a oa bet gortozet gantomp abaoe ma oa c'hoarvezet digresk ar fofoladur e 2020 DP2 er gwiad gwregel-mañ. Dre-se e kredomp e c'hallfe an EPP gourel bezañ treuzkaset e-pad ar pareañ. E gwirionez, hon eus implijet merkañ izotopoù stabil in vivo evit kuzhat ar protein merc'hed goude ar pareañ, un enzim anavezet gant MS en atriom ar parezed (Skeudenn 2c ha Taolenn ouzhpenn 1). Met n'eo ket bet kadarnaet bezañs EPP e MAG ha LRT parezed gwerc'h (LRT) met n'eo ket bet kadarnaet ivez implijout enepkorfoù resis (Skeudenn 2d).
a, Un hentenn bioinformatik savet war-eeun evit klask e gwiadoù engehentiñ pep reizh evit kavout genoù a enrineg EcKoù, EOoù hag EPPoù. An niveroù e-kichen ar biroù a ziskouez an niver a gannaded gourel ha merc'hed e pep pazenn. An dielfennadur-mañ en deus anavezet ur gen EPP (EPP) hag ur gen EcK (EK1) a vez eztaolet e genoù gwazed hag EK, unan (EcK2) a vez eztaolet en daou reizh met ne ginnig ket ur gen EO kannad.b, Heatmap o keñveriañ eztaol ar gen kannad e gwiadoù gwerc'h (V) ha pareañ (M) Anopheles gambiae hag Anopheles albicans.Spca, feurmiñ; MAGoù, gwagrennoù skoazell er baotred ; lodennoù all eus ar c'horf, en o zouez ar bronnoù, an divaskell, an divhar, ar c'horfoù lard hag an organoù diabarzh en daou reizh, hag an ovarioù er merc'hed.EcK2 a zo eztaolet kalz e MAG hag e atria Gambia, tra ma vez kavet EPP nemet e MAG.c, An analizenn proteomek eus treuzlec'hiadur ar strollad ejakulennoù gourel e-barzh ar merc'hed da 13e ha 22e, o tiskouez ar 67 protein a oa ar muiañ. Savet e oa bet ar merc'hed war ur died ennañ 15N evit merkañ (ha kuzhat) an holl broteinennoù. Ar baotred hep tikedenn a oa bet pareet gant ar parezed merket, ha LRToù ar parezed a oa bet disec'het da 3, 12 ha 24 hpm evit an dielfennadur proteomek (gwelet Taolenn ouzhpenn 1 evit roll klok ar proteinoù ejakulañ, EPP). Eck1 hag EcK2 a oa bet detektet e MAG ar baotred gwerc'h dre an dielfennadur proteomek eus ar gwiadoù-se. d, EPP a oa bet detektet dre western blot e MAG ha LRT ar parezed pareet, met n'eo ket e merc'hed gwerc'h pe ar baotred pe er peurrest eus korf ar merc'hed. Ar membranoù a oa bet sondet war un dro gant enepkorfoù enep-kargañ (EPP) hag enepkorfoù kontroll APP. gwerc'hezed. Gwelet ar skeudenn ouzhpenn 1 evit roadennoù ar font gel. Western blots a oa bet graet div wech gant disoc'hoù heñvel.
Gwiriekaet e oa bet obererezh fosfofosfataz an ekdisteroid EPP goude bezañ bet goret dre HPLC-MS/MS gant 3D20E22P distag diouzh MAG (Skeudenn 2a roadennoù astennet). Ouzhpenn-se, pa oamp bet sioulaet EPP dre zarempred dre RNA (RNAi), e oa bet detektet un digresk kreñv en obererezh fosfataz engehentiñ an tisufazoù-se ar baotred (Skeudenn 3a), hag ar parezed pareet gant ar baotred EPP-silenset a ziskouezas ur c'hementad pouezus A izeloc'h a 3D20E difosforilet (Skeudenn 3b) daoust d'ar silensadur parziel eus ar gened (Roadennoù astennet Skeudenn 2b,c). spesadel evit 3D20E22P (Skeudenn 3b).
a, Obererezh fosfataz digresketoc'h e MAG degaset gant sioulaat EPP dre implijout kontrolloù ARN EPP daou-neud (dsEPP) pe ARN GFP daou-neudenn (dsGFP). Implijet e voe ugent strollad MAG e pep eiladenn (P = 0,0046, t-test par, daou du), diskouezet gant domadoù dispartiet gant Feb. Ar baotred EPP-silenset o doa ur c'hementad kalz izeloc'h a 3D20E difosforilet da 3 hpm (P = 0,0043, t-test dic'houblad, divskoaz), tra ma ne oa ket bet gwallet liveoù 20E (P = 0,063, dic'houblad). t-test, daou du). Kinniget e vez ar roadennoù evel keitat ± sem eus teir strollad 13, 16 ha 19 parezed pep hini.c, Ar parezed pareet gant pared EPP-silenced o doa feuroù adpareañ kalz uheloc'h (P = 0,0002, test resis Fisher, divskoaz). Ar parezed a oa bet rediet da gentañ evit gwiriañ o statud pareañ ; 2 devezh diwezhatoc'h e voent darempred gant pared all o tougen sperm treuzgenek evit priziañ ar feur adkempenn dre zizoloadenn PCR kementadel an treuzgen.d, Ar merc'hed maget gant gwad pareet gant pared EPP-silenset o doa digresket kalz o frouezhusted (P < 0,0001; test Mann-Whitney, divskoaz) hag un tamm digresketoc'h an niver a vioù (P < 0,0001, = 0,000). Test Mann-Whitney, divskoaz) , tra ma ne oa ket bet gwallet ar feur gouennañ (P = 0,94, test resis Fisher, divskoaz). En holl banelloù e talvez n an niver a skouerennoù moustiked dizalc'h war an dachenn biologel.NS, n'eo ket talvoudus.*P < 0,05, **P < 0,01, ***000, *** P < 0,00 * P < 0,00.
Da c'houde, hon eus priziet hag-eñ eo pouezus an difosforiladur ecdyson evit lakaat ar parezed da vezañ nec'het ouzh ar pareañ. Dreist-holl, ar merc'hed pareet gant pared hep EPP a adkempenne gant ur frekañs kalz uheloc'h (44,9%) eget ar parezed kontroll (10,4%) pa vezent lakaet dirak pared ouzhpenn (treuzgenetek) (Skeudenn 3 Wc a oa bet kresket ivez). ar frouezhusted (Skeudenn 3d, kleiz) hag un digresk bihan en niver a vioù lakaet gant ar parezed-se (Skeudenn 3d, e-kreiz), tra ma ne oa ket bet gwallet ar c'hantved a vioù lakaet gant ar parezed (ur respont all degaset gant ar parezed dre ar c'houblad )) (Skeudenn 3d, dehou). Pa seller ouzh ar spesadelezh a oa bet gwelet gant an EPP evit an disoc'hoù-se e c'haller soñjal e c'hallfe an disoc'hoù EPP 2022 bezañ gwelet gweredekaat 3D20E gant EPP treuzkaset e-pad ar c'houblad a c'hell kaout ur roll pouezus evit diweredekaat degemer ar merc'hed d'ar c'houblad pelloc'h, ur c'homporter a oa bet lakaet da dalvezout a-raok evit treuzkas reizhel 20E. Dre-se e vez efedus-kenañ an hormon-se a denn d'ar baotred ivez war frouezhusted ar merc'hed.
Da c'houde, hon eus keñveriet obererezhioù 20E ha 3D20E en arnodoù ensinklañ war gwerc'hezed darev war an dachenn reizhel en ur implijout 3D20E sintezet kimiek (Skeudenn 4a–c) ha 20E a c'haller kaout war ar marc'had. Gwelet hon eus e oa 3D20E kalz efedusoc'h eget 20E evit serriñ ar c'honsentradur sensibel d'ar parezed (Skeudenn). 4d).Da skouer, an hanter eus live fiziologel 3D20E en LRT (1 066 pg goude an ensinkladenn e-keñver 2 022 pg goude ar pareañ) a lakaas ur c'hard eus ar merc'hed refrakter a oa 20 gwech uheloc'h eget live fiziologel 20E (361 pg goude an ensinkladenn) 24 eurvezh goude ar c'honsentradur uhelañ goude an ensinkladenn 18 pg goude ar c'hoari; Taolenn roadennoù astennet 1).An disoc'h-mañ a glot gant ar soñj ne laka ket treuzkas reizhel 20E da vezañ prantadoù dic'houest da vezañ pareet, ha diskouez a ra ivez 3D20E evel un elfenn bennañ evit gwarantiñ an darempred etre ar gerent hag ar vugale. 3D20E a oa ivez kalz oberiant eget 20E en amprouennoù lakaat vioù e-touez ar parezed gwerc'h (Skeudenn 4), ar pezh a laka da soñjal e oa ar feur lakaat vioù normal e-touez ar merc'hed gwerc'h (Skeudenn 4). a oa bet gwelet goude sioulaat darnel an EPP a oa abalamour d'an obererezh 3D20E a chome produet c'hoazh gant faktoroù merc'hed degaset gant ar c'houblad.
(a,b) 3D20E sintezet kimiek diwar 20E (a) gant un treuzfurmadur/efedusted uhel-kenañ (roadennoù kinniget evel keitat ± sem diwar teir reaktadur sintezenn dizalc'h) (b).c, ar spektrum tolz (an hanter izelañ) a glot rik gant an ecdysone kavet e LRT parezed pareet (an hanter uhelañ, keñveriet gant (E 2006). µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; test rik Fisher, div-skourr) ha 10% etanol (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisher's, 2000), tra ma oa 2000 s. eget ar c'hontroll nemet gant doareoù uheloc'h (0,63 μg, P = 0,0002; 0,21 μg, P = 0,54; test reizh Fisher, 2-tu).e, an ensinkladenn 3D20E a lakaas feur gouennañ kalz uheloc'h e-touez ar parezed gwerc'h eget 10% etanol (P = 0,000 μg, P = 0,54). 0,0001; 0,13 μg, P = 0,0003; Test rik Fisher, divskoaz), tra ma 20E keñveriet gant ar c'hontrolloù Nemet gant dozennoù uheloc'h (0,21 μg, P = 0,022; 0,13 μg, P = 0,0823 Fisher's rik e-barzh daou du; feuroù gouennañ kalz uheloc'h eget 20E gant doareoù uheloc'h (0,21 μg, P = 0,0019; 0,13 μg, P = 0,075; test reizh Fisher, div du). En holl banelloù e talvez n an niver a skouerennoù moustiked dizalc'h diouzh ar vevoniezh. ***P < 0,001, ****P < 0,001. Dont a ra ar roadennoù eus teir adlavarenn.
E studiadennoù kent hon eus termenet e vez broudet MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) gant an treuzkas reizhel eus an hormonoù steroid, ur gen engehentiñ merc'hed a warez ar parezed A. gambiae diouzh ar c'hleñved P. falciparum. lec'hioù ma vez kavet ar malaria, hon eus divizet termeniñ peseurt hormon 3D20E pe 20E a laka an eztaol eus ar gen-mañ da vont en-dro. Kavet hon eus e oa kreñvoc'h ar MISO 16, tra ma oa bet broudet gant an ensinkladenn 20E en un doare ispisial pe kreñvoc'h lod eus ar reseverien hormon nukleel (HR), evel HR3 ha HR4, ha palioù steroidoù a-is, evel ar genoù yolkogenek V114, broudet gant 3D20E (Roadennoù astennet Skeudenn 3). Evel-se e seblant an treuzkas reizhel eus an hormon steroid androgenek-mañ broudañ mekanikoù a warez ar merc'hed diouzh ar c'hostoù degaset gant ar c'hleñved parazitek. Ouzhpenn-se, 3D20E a efed disheñvel war an daou izofurm eus ar resever EcR, o tigreskiñ EcR-B hag o tigreskiñ muioc'h o lakaat da greskiñ kreñv genoù all a laka ar c'houblad da vezañ pareet, en o zouez HPX15, ar pezh a laka ar merc'hed da vezañ frouezhusted. Gallout a rafe displegañ an disterded pouezus a vez gwelet e-touez ar merc'hed pareet gant ar baotred EPP-silenced (Roadennoù astennet Skeudenn 3). Ar roadennoù-se a ziskouez ez eus hentoù a-is a vez gweredekaet dreist-holl gant daou hormon ecdyson a c'hellfe bezañ dindan arc'hwel ar reizh.
Da c'houde, hon eus amprouet arc'hwel an daou gen EcK anavezet en hor c'heflusker bioinformatik. Sioulaat EcK1 pe EcK2 a zegasas ur marv pouezus e-touez ar baotred (Roadennoù astennet Skeudenn 4a), ar pezh a laka da soñjal eo pouezus fosforiladur an ecdyson, ha dre-se an diweredekaat, evit ar surentez. Rak EcK2 a oa bet eztaolet uheloc'h eget liveoù EcK1 hag e oa uheloc'h eget EcK1 detektet e MAGoù dre ar proteomik (Skeudenn 2b,c ha Taolenn ouzhpenn 2), hon eus kadarnaet e obererezh ekdisteroid kinaz dre e enkubañ gant 20E, ar pezh a zegasas fosforiladur 20E22P (Skeudenn roadennoù astennet 2).4b).Pa veze implijet 3D20E evel isstrad, e oamp dizoloet ar produioù luc'hskeudennet 3D20E22P (Roadennoù astennet Skeudenn 4c), ar pezh a laka da soñjal e c'hallfe 20E e-lec'h 3D20E bezañ ar pal gwellañ evit EcK2.
Hervez hon dielfennadur RNA-seq e oa bet eztaolet kalz EcK2 ivez e LRT ar parezed gwerc'h, ma oa bet diweredekaet goude ar pareañ (Skeudenn 2b). Kadarnaet hon eus ar roadennoù-se ha termenet hon eus ne oa ket bet efedus an eztaol EcK2 gant ar magadur gwad (Roadennoù astennet Skeudenn 5a). O astenn hor c'hentañ arnodoù MS, hon eus termenet e oa tost-tre ar pik eus 2020 EcK2 liammet ouzh ar pik 20E (22-26 eurvezh goude ar pred gwad; Roadennoù astennet Skeudenn 5b). Sioulaat EcK2 e-touez ar merc'hed gwerc'h a lakaas ur c'hresk 3 gwech er feur 20E da 20E22P da 26 eurvezh goude ar pred gwad (Skeudennoù roadennoù astennet 2c ha 5b), ar pezh a gadarna ivez e 20E er parezed. Dreist-holl, ar gwerc'hezed hep EcK2 o deus miret o degemer reizhel leun (Roadennoù astennet Skeudenn 5d,e), ar pezh a ziskouez ivez ne laka ket ar parezed 20E da greskiñ prantadoù refrakter d'ar c'houblad. Koulskoude, ar parezed-se o doa kresket kalz ar feur lakaat vioù e-keñver ar re kontroll, gant muioc'h eget 30% a vioù gwerc'hezed (Roadennoù astennet Skeudenn 5f). Ma veze graet ensinkladennoù Eck2 RNA (dsEcK2) goude bezañ bet maget gant ar gwad, ne c'hoarveze ket ar c'hrouiñ, d'ar mare-se e oa digresket ar pik 20E abalamour d'ar gwad debret. Dre vras, an disoc'hoù-se a skoazell ur patrom ma c'hall ar 20E produet goude sunañ gwad broudañ ar c'hrouiñ, met pa vez stanket ar c'hrouiñ hepken (EK2 marteze faktoroù all) a vez diweredekaet dre ar c'houblad. Ne harz ket an ensinkladennoù 20E na 3D20E an eztaol EcK2 e-touez ar gwerc'hezed (Roadennoù astennet Fig. 5g), ar pezh a laka da soñjal e vez harzet ar kinaz-se gant faktoroù all. Koulskoude, liveoù 20E goude ar magadur gwad ne oant ket a-walc'h evit degas an dic'hoant, met degaset e oant bet efedus gant titeroù uhel 3D20E treuzkaset dre reizh.
Gant hon disoc'hoù e vez kinniget titouroù pouezus diwar-benn an doareoù a reol berzh engehentiñ A. gambiae. Ur patrom zo deuet war wel ma'z eus bet emdroet ar baotred evit sinteziñ titloù uhel a 3D20E, un ekdison kemmet a-ratozh evit ar baotred hag a warant ar gerent dre zizalc'hiañ ar parezed evit mont pelloc'h gant ar pareañ. Er memes koulz, ar vektorioù-se o deus ivez diorroet ur reizhiad efedus evit ar malared evit sevel ur reizhiad efedus evit ar c'houblad. lakaat 3D20E da vont en-dro er merc'hed e respont d'an treuzkas reizhel eus an EPP spesadel d'ar baotred. D'ar pezh a ouzomp, setu ar skouer gentañ eus ur reizhiad hormonoù steroid mestroniet gant ar baotred hag ar merc'hed o seveniñ ur fonksion dibar ha pouezus en amprevaned. Postulet eo bet ar fonksion ecdyson spesadel evit ar baotred met n'eo ket bet diskouezet en un doare dibar. a c'hell bezañ graet gant ar prekursor 20E E1. Anavezet mat eo e vez degaset ar monandriezh e Drosophila gant treuzkas reizhel peptidoù reizhel bihan19,20 a genderc'h gant neuronoù a nerzh an hent engehentiñ merc'hed dre reseverien peptidoù reizhel resis21,22.Ret eo ober muioc'h a labour evit termeniñ ar c'haskadoù sinal a-is kontrollet gant gambia A20D A20. parezed ha gouzout hag-eñ e c'haller mirout ar c'haskadoù-se etre ar moustiked hag an Drosophila.
Pa seller ouzh perzh pouezus 3D20E war frouezhusted ha emzalc'h ar merc'hed anavezet en hor studiadenn, an hentoù a gas da sintezenn ha da aktivadur 3D20E a ginnig digarezioù nevez evit strategiezhioù kontrollañ ar moustiked da zont, evel ar c'henderc'hañ pared steril kenstrivadel e strategiezhioù teknologiezh amprevaned steril Implijit evit skarzhañ gouez pe evit heuliañ ar c'hoari gwerc'h e-barzh arc'hwel spesadel 3D20E. 3D20E a c'hellfe bezañ bet emdroet pa oa bet tapet gant A. gambiae ha spesadoù Cellia all ar galloud da goagulañ o sper e-barzh ar c'houbladoù pareañ, rak gant se e c'haller treuzkas en un doare efedus niver bras a hormonoù hag enzimoù a laka an hormonoù da vont en-dro. En e dro, an emdroadur 3D20E o lakaat e pleustr ar monandry a ginnig ur mekanik d'ar merc'hed (SO) uhel evit eztaol o barregezh engehentiñ lec'hioù ma vez kavet kalz a malaria, ar pezh a gemer perzh en un doare dieeun e treuzkas Plasmodium. Dre ma'z eo bet diskouezet e vez efedoù pouezus gant 20E merc'hed war bevañs ha kresk P. falciparum e moc'h Anopheles parezed,24 an hentoù hormonoù steroid gourel ha merc'hed a zo bremañ elfennoù pennañ an etregweredoù etre ar moc'h-parazited.
Savet e oa bet ar spesadoù A. gambiae G3 dindan an amprevaned skoueriek (26-28 °C, 65-80% a glebor keñverel, 12:12 eurvezh luc'hskeudenn/teñval). Bouetaet e oa bet al larvennoù gant boued pesk poultrennek (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets ha Tetra Pond Sticks en ur feur a 7:7:A). maget e veze ar moustiked ad libitum gant un disoc'h dekstroz 10% ha gwad denel bep sizhun (elfennoù gwad ar studiadenn). Moc'h gwerc'h a voe tapet dre zispartiañ ar reizhoù er mare pupal goude bezañ sellet ouzh o pennoù dre mikroskopiezh. Deskrivet eo bet ar pared o tougen an treuzgen DsRed a-raok.
Arnodennoù pareañ rediet a oa bet graet hervez ar c'homenadoù deskrivet a-raok. Evit ar pareañ naturel e oa bet miret ar parezed gwerc'h 4 devezh oad en ur feur 1:3 gant ar pared gwerc'h darev war an dachenn reizhel e-pad daou nozvezh. Evit an arnodoù ma oa bet injektet dsEPP d'ar pared, e oa ar c'ho-kaouiñ keñveriet gant an devezhioù 3-4 goude an injektañ, pa oa bet lakaet an obererezh fotaziek en un doare silens uhelañ (Roadennoù astennet Skeudenn 2b).
Gwiadoù ar moustiked, ar re all eus ar c'horf (ar peurrest eus ar c'horf), pe ar c'horf a-bezh a voe dizoloet e 100% metanol hag homogenizet gant ur perlez (2 mm perlez gwer, 2 400 troatad dre vunutenn, 90 eilenn). Ar c'hementadoù gwiadoù hag ar volumoù metanol a oa evel-henn : ar peurrest eus ar c'horf, 500 μl e 100 μl ; MAG, 50–100 80 μl; LRT merc'hed, 25–50 80 μl. An eil tennadur metanol a voe lakaet da dalvezout gant ar memes volum metanol. Lastez ar c'helligoù a voe tennet dre greizennañ. Ar metanol eus an daou eztennañ a voe kemmesket ha sec'het dindan red nitrogen, ha goude-se e voe adlakaet er c'hementadoù da-heul a 80% metanol e-barzh dour ar c'horf, μl; MAGoù ha LRT merc'hed, 30 μl.
Anavezout a reer ar skouerennoù war ur spektrometr tolz (ID-X, Thermo Fisher) stag ouzh ur benveg LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 μl a skouerenn a voe enporzhiet war ur golonenn 3 μm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) miret da 25 °C. (dour, 0,1% asid formek) ha B (asetonitril, 0,1% asid formek). Ar gradient LC a oa evel-henn : 5% B e-pad 1 vunutenn, ha goude-se kresket da 100% B e-pad 11 munutenn. Goude 8 munutenn da 100%, adkempennet ar bann da 5% B e-pad 4 munutenn. Ar feur red a oa 30 ml. min-1. An ionizadur er font MS a vez kaset da benn dre an ionizadur dre strinkañ tredan tomm e modoù pozitivel ha negativel.
Muzuliañ a ra ar spektrometr tolz roadennoù er rann m/z eus 350 da 680 gant ur resolution 60 000 e mod MS leun. Roadennoù MS/MS a oa bet prenet war [M + H]+ (an holl dalc'hoù), [M - H2O + H]+ (an holl palioù), ha [M - H]- (roadennoù fosforilet/MS/MS a oa bet implijet evit kadarnaat perzhioù ar palioù). ne oa ket bet kavet ur standard ebet. Evit anavezout an ekdisteroidoù nann-tarzhet e oa bet dielfennet roadennoù MS/MS evit an holl begoù HPLC gant >15% a bouez keñverel. Kementadur dre implijout krommennoù skoueriek savet diwar standardoù glan (20E, 3D20E) evit jediñ ar c'hementadoù pe an diluzioù eus ur skouerenn resis all (an holl skouerennoù all) evit jediñ ar c'hementad kavet en unan gourel.Evit 3D20E e oa bet graet ar c'hantvedoù dre implijout sammad an aduktoù da-heul : [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Tennet e oa bet ar roadennoù ha muzuliet e oa bet gant Tracefinder (stumm 4.1). Anavezet e oa bet ar roadennoù MS/MS dre implijout ar burzhud XMS (stumm 4.4). keñveriet e voe spektroù E, 20E ha 3D20E ouzh ar standardoù a-fet. 3D20E22P a voe dielfennet dre deveratadur gant reagent Girard. 20E22P a voe dielfennet dre feur m/z.
3D20E22P a oa bet puraet diwar MAG. Graet e oa bet ar puraat war ur skalfad dielfennañ dre implijout ur c'hromatograf liñvel ultra-perzhded (Acquity, Waters) gant un detekter diazezet war ar mas pevarpol (QDa, Acquity, Waters) dindan an hevelep doareoù LC hag an dielfennadur HPLC-MS/MS. Degaset e oa bet ar fraksion pa oa bet keñveriet ar mz/z 3D20E22P a oa bet detektet d'ar memes amzer dalc'h evel ma oa bet termenet a-raok. Goude-se e oa bet gwiriet purded ar c'hevanadoù tennet dre HPLC-MS/MS evel deskrivet a-us.
Tennañ a reer an ARN hollek eus 10-12 gwiad engehentiñ pe lodennoù all eus ar c'horf (hep penn) dre implijout ar reagent TRI (Thermo Fisher) hervez titouroù ar c'henderc'her. An ARN a oa bet tretet gant TURBO DNase (Thermo Fisher). An cDNA a oa bet sintezet dre implijout ar virus leukemiezh Moloney murine reverse treuzskrivadur (MLVRT; Fisher) o heuliañ titouroù ar c'henderc'her. Primeroù evit ar PCR kementadel dre dreuzskrivañ en-dro (RT-qPCR; Taolenn roadennoù astennet 2) a oa bet embannet a-raok24 pe savet gant Primer-BLAST26, gant ar gwellañ roet d'ar produioù 70-150 bp o ment hag a ya d'ober kroashentoù exon-exon pe prieroù prionoù distag eus teir skouer NAcD. diluet e voe an eiladennoù biologel pevar gwech en dour evit RT-qPCR. Graet e voe ar c'hementad e 15 μl a reaktadennoù eilañ enno 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primeroù, ha 5 μl a cDNA diluet. Ar reaktadennoù a voe kaset da benn war ur reizhiad QuantStudio PCR amzer-gwirion (Thermo Fisher) ha roadennoù Fihermo dastumet ha dielfennet dre implijout Design and Analysis (stumm 2.4.3). Evel m'eo bet diskouezet er studiadenn-mañ, e oa bet normalaet ar c'hementadoù keñverel d'ar gen ribosomal RpL19 (AGAP004422), ha n'eo ket bet cheñchet kalz e eztaol gant ar boued gwad 27 pe ar c'houblad 3 .
Kalite an ARN a oa bet gwiriet gant ur bioanalyzer Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent). Levraouegoù Illumina paired-end a oa bet prientet ha kaset da benn e Broad Institute of MIT ha Harvard. Al lennadennoù heuliañ a oa bet liammet ouzh genom A. gambiae (strollad PEST, stumm 4.12) dre implijout HISAT (diverrañ 2025). arventennoù. Tennet e oa bet al lennadennoù gant skoroù kalite kartennaouiñ (MAPQ) <30 gant Samtools (stumm 1.3.1). Kontet e oa bet an niver a lennadennoù kartennaouet ouzh ar genoù gant htseq-count (stumm 0.9.1) gant arventennoù dre ziouer. Kontet e oa bet ar c'hontadennoù lennadennoù normalaet hag an eztaol genel diforc'hel a oa bet dielfennet dre implijout ar pajenn DEQ2 1.28.1) e R (stumm 4.0.3).
Anavezet e oa bet ar c'hannaded genoù a gemm an ekdison dre glask da gentañ e genom A. gambiae dre implijout an algoritm PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), dre implijout talvoudoù dre ziouer Parametroù gant an heuliad goulenn da-heul : heuliad protein ar c'hemm eus Boc'h (A. NP_001038956.1), Musca domestica (Niv. mont e-barzh XP_005182020.1, XP_005175332.1 ha XP_011294434.1) ha Microplitis demolitor (Niverenn mont e-barzh XP_00852641646165615150150150151 ha eus B. mori (niv. mont e-barzh NP_001036900), Drosophila melanogaster (niverenn mont e-barzh NP_651202), Apis mellifera (niverenn mont e-barzh XP_394838) hag Acyrthosiphon pisum (niverenn mont e-barzh XP_001947166); ha EPP eus B. mori (Niv. mont e-barzh XP_001947166) NP_001177919.1 ha NP_001243996.1) hag EO eus D. melanogaster (Niverenn mont e-barzh NP_572986.1) (pazenn 1). Da c'houde, silañ an eztaol uhel diazezet war RNA mRNA (00>100) tammoù/exonoù kilobaz dre vilion a lennadennoù kartennaouet (FPKM) pe >85%) e gwiadoù engehentiñ (LRT pe MAG merc'hed) e Gambia (pazenn 2 ). Evit gwellaat ar spesadelezh hon eus dibabet enzimoù kannad a vez eztaolet ivez e gwiad engehentiñ A. albimanus, ur spesad anopheles na sintez ket pe ne dreuzkas ket ekdison e-pad ar c'houblad. Ar genoù kannad a oa bet silet diwar un eztaol izel (<100 FPKM pe <85vet dregantad) e gwiad engehentiñ A. albimanus (Ap 3 pazenn diwezhañ). sil (pazenn 4), ar genoù kannad a rank satisfañ unan eus ar re-mañ da nebeutañ : (1) reoliet kalz goude ar c'houblad (P < 0,05) hervez an dielfennadur eus ar genoù eztaolet en un doare disheñvel ha (2) e gwiadoù nann-produiñ (< 85 % pe <100 FPKM).
Kemmet hon eus an doareoù deskrivet a-raok 28,29,30 evit tizhout tikedenniñ izotopoù an organeg a-bezh. E berr gomzoù, Saccharomyces cerevisiae seurt II (YSC2, Sigma) a seurt gouez a oa bet amprouet e bazenn nitrogen goell (BD Difco, DF0335) ennañ (pouez/vol) 2% gluz, Sigma, 275%. hep asid amino ha sulfat amoniom. endro sevenadurel) ha 5% 15N sulfat amoniom (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) evel ar font nemeti a nitrogen. Adkavet e voe ar goell dre greizennañ ha maget e voe larvennoù ar moustiked ad libitum betek ar pupadur. Ouzhpennañ gant bleud-pesked (0,5 mg 300 dre larvenn) evit mirout ouzh ar pevare steredenn da virout ouzh ar pevare steredenn. marv. Ar parezed hepken a voe implijet neuze en arnodoù pareañ gant pared hep tikedenn evit dielfennañ ar proteom gourel treuzkaset e-pad pareañ.
Ret e oa bet d'ar parezed gwerc'h 15N-tagged 4-6 devezh oad pareañ gant parezed gwerc'h hep tikedenn a oa heñvel o oad. Gwiriekaet e oa bet ar c'houblad a-stroll dre zizoleiñ tapoù pareañ dindan mikroskopiezh epifluoresañs. Da 3, 12 ha 24 hpm e oa bet rannet atriaoù 45-55 merc'hed pareet e-barzh 50 μl ammonium tampon bikarbonat (pH 7,8) hag homogenezet gant ur pestle. An homogenad a voe greizennet hag ar surnatant a voe mesket gant 50 μl a 0,1% RapiGest (186001860, Waters) e 50 mM bikarbonat amoniom. Ar surnatant hag ar pellet eus pep skouerenn a voe kaset war ar skorn ha kaset dreist da labouradeg MacCoss e Skol-veur Washington, ma oa bet echuet prientiñ ar skouerennoù evit LC-MS/MS. Adlakaat ar pellet e 50 μl a 0,1% RapiGest e 50 mM bikarbonat amoniom ha sonikaat en ur banne dour. Muzuliet e oa bet ar c'hementad protein eus ar pellet hag eus ar surnatant gant an amprouenn BCA, digreskiñ a reer ar skouerennoù gant 50 mM (DTT; Sigma), alkilet gant 15 mM iodoacetamid (Sigma) hag enkubet da 37 °C (1:0 50) e-pad 1 eurvezh gant tripsinizadur: keñver tripsin:substrad). RapiGest a voe lizet dre ouzhpennañ 200 mM HCl, heuliet gant enkubet da 37 °C e-pad 345 munutenn 14 000 rpm e-pad 10 munutenn da 4 °C evit tennañ an dilerc'hioù. Gwalc'het e voe ar skouerennoù dre eztennañ daou zoare e fazenn solut (kartoñsoù Oasis MCX, Waters) hag adlakaet e voent en asid formek 0,1% evit ur c'hementad protein diwezhañ a 0,33 μg μl-1. G a oa bet merket gwerc'h gant MA G a oa bet dielfennet en un doare heñvel. gwazed. Daou eiladenn analitikel a voe dielfennet evit pep skouerenn. Da c'houde e voe dielfennet 1 μg eus pep hini dre implijout ur golonenn 75 μm silik fuzet 25 cm gant ur trap frit Kasil1 (PQ) 4 cm silik kenstaget paket gant rest Jupiter C12 a-dreñv-faz (PQ) ha liñvenn 18 kromatografiezh. Digeriñ ar skouerennoù – MS/MS a oa bet kaset da benn war ur spektrometr tolz Q-Exactive HF (Thermo Fisher) gant ur reizhiad nanoACQUITY UPLC (Waters). Roadennoù dastum liammet ouzh ar roadennoù bet krouet evit pep troiad a oa bet amdroet e stumm mzML dre implijout Proteowizard (stumm 3.0.2027) ha dre implijout Comet (stumm 3.0.2027) a-enep ar stumm 3.33. Diaz roadennoù FASTA ennañ heuliadoù proteinoù eus Anopheles gambiae (VectorBase stumm 54), Anopheles coluzzi Ur c'hlask a oa bet graet war Mali-NIH (VectorBase stumm 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, miz Meurzh 2021), A. gambiae RNA-seq, ha tri framm treuzkas eus saotradurioù anavezet gant an dud. FDRoù heñvel ouzh ar gartenn a oa bet termenet dre implijout Percolator32 (stumm 3.05) gant un troc'h a 0,01, ha peptidoù a oa bet bodet en anavezadennoù protein dre implijout parsimoniezh protein e Limelight33 (stumm 2.2.0). Priziet e oa bet ar pouez protein keñverel dre implijout ar faktor pouez spektrel normalaet (NSAF) jedet evit pep redadeg NSAF evel deskrivet a-raok. e-keñver pep protein a oa bet keitatet a-hed ar skouerennoù eus daou eiladenn biologel disheñvel. 15N labelaat a oa bet kuzhet gant berzh ar proteom merc'hed, daoust ma oa bet detektet un tamm bihan a brotein hep merket diwar ar gwerc'hezed merket. Enrollet hon eus dizoloadenn digresk ar protein gourel (1-5 spektr) e skouerennoù c'hrouet merc'hed nemet e skouerennoù teknikel c'hrouet, ma oa bet redet ar skouerennoù c'hrouet gourel/gour skouerennoù, evel disoc'h “treuzkas” HPLC. Proteinoù a-wechoù kavet evel 'saotradurioù' diwar gwerc'hezed merket a zo meneget e Taolenn ouzhpenn 1.
Daou peptid antigenek, QTTDRVAPAPDQQQ (e-barzh an izotip PA) ha MESDGTTPSGDSEQ (e-barzh an izotip PA ha PB) e Genscript. An daou beptid a voe kendeuzet, goude-se e voent kenstaget ouzh ar protein douger KLH hag enporzhiet e lapined Zeland-Nevez. Aberzhet e voe ar c'honikled goude ar pevare ensinkladenn, ha dizoloet e voe IG G purification.IgG eus ar c'honikl EPP-spesifikañ a oa bet implijet evit ar western blotting pelloc'h.
Evit ar western blots, MAG (n = 10, ma talvez n an niver a skouerennoù moustiked dizalc'h biologel) ha LRT parezed (n = 30) eus pared gwerc'h 4 devezh oad ha parezed gwerc'h pe pareet dre nerzh (<10 goude ar pareañ), Tampon tennañ protein (50 mM Tris, 80; pH-20% ; dezoksikolat sodiom; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× cocktail inhibitor proteaz (Roche)) a oa bet ouzhpennet war-eeun. Ar skouerennoù a oa bet homogenezet diouzhtu goude an disec'hañ gant ur perlez (2 mm perlez gwer, 2 400 rpm, 90 eilenn a oa bet tennet dre zizoloadenn 20 g). da 4 °C. Ar proteinoù a voe muzuliet dre an analizenn Bradford (Bio-Rad). Neuze, 20 μg a brotein MAG, 40 μg a brotein LRT, ha 20 μg a brotein a chom a voe denaturet ha dispartiet gant 10% Bis-Tris NuPAGE dre implijout tampenn MOPS. Treuzkaset e voe ar proteinoù d'ar membranenn polidien fluor B reizhiad treuzkas (Thermo Fisher). Gwalc'het e voe ar membranennoù div wech e 1× PBS-T (0,1% Tween-20 e PBS) ha goude-se e voent stanket e-barzh un tamm stankañ Odyssey (Li-Cor) e-pad 1 eurvezh da 22°C. Hejet e voe ar membranennoù e-pad an noz da 4 °C gant enepkorfoù poliklonel enep-EPP personelaet gant ar c'honikl (10:17) tampon) hag enepkorf kentañ monoklonal enep-aktin rat MAC237 (Abeam; 1:4,000). Gwalc'het e voe ar membranennoù gant PBS-T ha goude-se e voe enkubet gant enepkorfoù eilrenk (enep-konikl 800CW hag enep-rat 680LT (Li-Cor), an daou 1:2000, 100% enno tampon. SDS ha 0,2% Tween -20 e-pad 1 eurvezh da 22 °C. Gwalc'het e voe ar membranennoù gant PBS-T ha skeudennaouet gant ur skanner Odyssey CLx. Dastumet ha treuzfurmet e voe ar skeudennoù en Image Studio (stumm 5.2). N'eo ket bet kavet ur bann resis a glot gant an izoform EPP-RA (82 kDa).
Ar rannvroioù kodañ eus EPP (evel izoform AGAP002463-RB ennañ domani histidin fosfataz, klask domani miret NCBI 34) hag EcK2 (AGAP002181) a oa bet klonet e plasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma) ; ar c'hentañ a zo meneget e taolenn roadennoù astennet 2. Eizh liamm GS4 (a-gevret) a oa bet ensoc'het a-raok an dikedenn C-terminal 6xHis eus ar savadur pET-21a(+)-EcK2. Proteinoù adkempennet a oa bet produet dre ar reaksion sintezenn protein E. coli hep kelligoù NEBExpress (NewLabs BioExpress a oa bet produet gant proteinoù treuzfurmet NEBExpress). Ni spin columns (New England BioLabs). Produet e oa bet ar protein kontroll dihydrofolate reductase (DHFR) dre implijout ur patrom TDN eus ar NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. Ar proteinoù a oa bet miret e 50% gliserol e PBS da -20 °C e-pad betek 3 miz.
Muzuliañ a reer obererezh fosfataz an EPP hag an tennadoù gwiadoù dre implijout fosfat 4-nitrofenil (pNPP; Sigma-Aldrich). En tampenn reaktadur e oa 25 mM Tris, 50 mM asid asetek, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 10 mM MTA, ha 1 mM MTA. DTT. Homogenezet e voe ar gwiad e-barzh ur c'heflusker reaktadur ha tennet e voe an dilerc'hioù kelligoù dre greizennañ. Kregiñ a reer gant an argerzh en ur ouzhpennañ un enzim pe un tenn gwiad d'ar c'heflusker reaktadur ennañ 2,5 mg ml-1 pNPP. Enkoubaet e voe ar meskaj reaktadur e temperadur ar gambr en deñvalijenn, ha muzuliet e voe ar c'hementad pNN dre vuzuliañ pPP an absorbañs da 405 nm e mareoù disheñvel.
Evit an obererezh EcK in vitro e oa bet goret ar protein gant 0,2 mg 20E pe 3D20E e 200 μl tampon (pH 7,5) ennañ 10 mM HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP ha 10 mM MgCl2 evit 27 °C. Paouezet e oa bet gant un obererezh en-dro 800 μl metanol, goude-se yenaet da -20 °C e-pad 1 eurvezh, goude-se sentrifuget da 20 000 g e-pad 10 munutenn da 4 °C. Goude-se e voe dielfennet ar surnatant dre HPLC-MS/MS. Evit diweredekaat ar proteinoù implijet er strollad kontroll, e voe enkubet ar proteinoù e-barzh 50% PBS e-pad 20 % 95°C.
Evit an obererezh EPP in vitro e oa bet enkubet ar protein gant 3D20E22P (kevatal d'ar c'hementad a gaver e 18 koublad MAG, puraet dre HPLC-MS/MS) e 100 μl tampon (pH 7,5) ennañ 25 mM Tris, 50 mM asid asetek, 50 mM mM Bi-Tris, 50 mMs NaCl, 0,1 mM EDTA, ha 1 mM DTT e-pad 3 eurvezh da 27 °C. Ar reaktadur a voe paouezet dre ouzhpennañ 400 μl metanol ha yenaet da -20 °C e-pad 1 eurvezh, goude-se e voe greizennet da 20 000 g e-pad 10 munutenn da 4 °C. Anavezet e voe an supertantant dre MSLC/HP.
Tammoù PCR evit EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) hag EcK2 (556 bp) a oa bet kreñvaet diwar cDNA prientet diwar korfoù mousc'hoarzh hep penn a reizh mesk-ha-mesk. An tamm PCR eus ar c'hontroll eGFP (495 bp) a oa bet kreñvaet diwar ar pCR-FPG deskrivet a-raok; Ar c'hentañ PCR a zo meneget e taolenn roadennoù astennet 2. Ensoc'het e oa bet an tamm PCR etre ar promotourien T7 en em droet war ar plasmid pL4440. Adtapet e oa bet ar savadurioù plasmid diwar E. coli barrek war NEB 5-α (New England Biolabs) ha gwiriekaet dre heuliañ an TDN a-raok o implij (gwelet ar roadennoù ouzhpenn evit heuliañ an heuliad PL4440). ar promoter T7 (Taolenn roadennoù astennet 2) a voe implijet evit kreñvaat an ensoc'h eus ar plasmid diazezet war pL4440. Kadarnaet e voe ment ar produ PCR dre elektroforezenn gel agaroz. Treuzskrivet e voe an dsRNA diwar patromoù PCR dre implijout ar Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) ha puraet hervez titouroù ar c'hemmoù deskrivet a-raok.
Evit an ensinkladenn dsRNA e oa bet ensinklañ 1 380 ng a dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) gant ur c'hementad a 10 ng nl-1 e-barzh brusk ar baotred pe ar merc'hed oad (Nanojekt III, Drummond) e-kerzh 1 devezh goude an eklosion. Ar c'hnockdown genetek a oa bet termenet dre dri adlavarenn da nebeutañ Tennañ ARN, sintezenn cDNA, ha RT-qPCR. Evit an ensinkladenn ecdysone e voe ensinklañ 0,13, 0,21 pe 0,63 μg a 20E pe 3D20E (Nadrom III, Dmond, 213, d'ar parezed gwerc'hez 4 devezh pe 6 devezh. hervez an tres arnodiñ pe 6,3 ng nl-1. Enlakaat 100 nl a etanol 10% (vol/vol) en dour ; 100 nl a 3D20E22P e 10% etanol (kevatal da 75% eus ar c'hementad kavet en ur c'houblad MAGoù). Lakaet e voe ar moustiked dre zegouezh er strollad ensinklañ.
Evit an testenioù dispac'hañ e veze maget gwad mab-den d'ar parezed 3 devezh oad. Lemel ar moustiked bouetaet tamm-ha-tamm pe nann. Hervez an tretañ e veze lakaet ar parezed e tasoù distagañ distag e-pad pevar nozvezh da nebeutañ 48 eurvezh goude ar pred gwad. Kontet e veze an vioù dindan ur stereoskop (Stemi Zeis, 508); evit ar parezed pareet e veze sellet ouzh ar vioù a zeue da vezañ larvennoù evel frouezhus.
Evit an amprouennoù pareañ e oa bet aotreet d'ar merc'hed da nebeutañ 2 devezh diouzh an tretañ evit ma c'hallfent enebiñ ouzh ar pareañ, ha goude-se e oa bet lakaet ar baotred gouez a oa heñvel o oad er memes kaoued. Daou nozvezh goude e oa bet disec'het ar vesikuloù frouezhus parezed hag e oa bet skarzhet an TDN genomek dre skorn-dizoloiñ ha sonikaat en ur bufer endalc'het 10 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, ha 25 mM NaCl (pH 8,2). Enkoubaet e voe ar skouerennoù gant Proteinase K (0,86 μg μl-1) e-pad 15 munutenn da 55 °C, heuliet gant 10 munutenn da 95 °C. Prientiñ an TDN genomek kriz a voe diluet gant PCR kozh Q 10 ha sujet da ziverkañ Y heuliadoù ar c'hromozomoù; ar c'hentañ a zo meneget e taolenn roadennoù astennet 2. An ezvezañs eus heuliad ar c'hromozom Y a ziskouez n'eus ket bet pareet.
Evit an testenioù adkempenn e voe studiet ar merc'hed pareet dre nerzh evit gouzout hag-eñ e oa tapoù pareañ evit kadarnaat ar statud pareañ ha lezet e voe 2 devezh da ziorren o nerzh ouzh ar pareañ pa ne oa ket ar baotred, evel ma oa bet deskrivet a-raok 36 .Neuze e voe lakaet ar parezed o tougen spern treuzgenek DsRed e-barzh kaouedoù ar parezed e-pad an noz, diwezhatoc'h e voe feurmet al legumaj. dizoloet diwar ar parezed, ha prientet an TDN genomek evel deskrivet a-us ha lakaet da zizoleiñ dre qPCR an treuzgen DsRed ; ar c'hentañ a zo meneget e taolenn roadennoù astennet 2. An ezvezañs eus an treuzgen DsRed a ziskoueze ne oa ket c'hoarvezet adkempenn ebet.
3D20E a oa bet sintezet evel deskrivet a-raok 37 .E berr gomzoù, 10 mg a 20E (Sigma-Aldrich) a oa bet dizoloet e 10 ml dour, ha goude-se e oa bet ouzhpennet 30 mg a platin du (e stumm poultr, Sigma-Aldrich). Ur red dous a O2 a oa bet adkempennet e-barzh ar meskaj, hag a oa bet adkempennet e temperadur ar gambr. Goude 6 eurvezh e voe ouzhpennet 30 mL a metanol evit paouez gant ar reaktadur. Ar meskaj a voe sentrifuget evit tennañ rannigoù ar c'hatalizator. Ar surnatant a voe evaporet betek sec'hañ e vakuum da demperadur ar c'hambr. Ar produ sec'h a voe teuzet e etanol 10% hag e metanol evit an analizañ feur ensinkladenn LCMS/HPMS. (eus 20E da 3D20E) a oa war-dro 97% (Skeudenn 4b), ha spektrum MS an 3D20E sintezet a glot gant ar pezh a gaver er parezed pareet (Skeudenn 4c).
Er vojenn e kaver munudoù resis eus an testenioù stadegel bet graet.GraphPad (stumm 9.0) a oa bet implijet evit ober an test resis Fisher, an test Mantel-Cox hag an test t Student. An testenioù Cochran-Mantel-Haenszel a oa bet graet gant ur skript R personelaet (kavet e https://github.com/haenszel. An dasparzh a oa bet testeniekaet). evit ar normalelezh dre implijout an test Shapiro-Wilk gant un troc'h talvoudegezh a 0,05. Pa c'hwitas ar roadennoù en test normalelezh e voe graet an test Mann-Whitney. Anavezout a reer ar roadennoù dreistbevañ dre implijout an test Mantel-Cox. Implijet e voe ar pakad DESeq2 (stumm 1.28.1) evit ober un dielfennadur diforc'hel eus an eztaol genetek live RNA war ar varrenn. a zastum ar c'hreiz. Ur werzh talvoudegezh P = 0,05 a oa bet implijet evel troc'h evit an holl amprouennoù.
Evit gouzout hiroc'h diwar-benn tres ar studiadenn, sellit ouzh an diverradenn Nature Research Report liammet ouzh ar pennad-mañ.
Roadennoù proteomek MS a oa bet lakaet e ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) dre ar PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) gant an anavezer roadennoù PXD032157.
Enrollet eo ar roadennoù RNA-seq el levraoueg hollek evit an eztaol genetek (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) dindan an enrolladenn heuliad GSE198665.
Roadennoù ouzhpenn bet krouet ha/pe dielfennet e-kerzh ar studiadenn-mañ a c'haller kaout digant an aozerien a glot gant ur goulenn reizh. Ar pennad-mañ a ginnig ar roadennoù orin.
De Loof, A. Ecdysteroids: Neglected insect sex steroids?Male: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone ha diorren an ovarioù en Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).