Ur perzh pennañ eus mikroendro ar tumor (TME) eo ar metabolitoù immunomodulañ, met gant un nebeud diforc'hioù e chom dianav o identelezh dre vras. Amañ hon eus dielfennet ar c'hrign-bev hag ar c'helligoù T eus ar c'hrign-bev hag an askit eus ar c'hlañvidi gant karsinom serous uhel (HGSC) evit diskuliañ metabolom ar c'hompartimantoù TME disheñvel-se. Diforc'hioù metabolit bras a zo gant an askited hag ar c'helligoù tumorel. Keñveriet gant an askit, ar c'helligoù T a enframmañ ar tumor a zo pinvidikaet kalz gant 1-metilnikotinamid (MNA). Daoust ma vez uhelaet live an MNA er c'helligoù T, ez eo bevennet an eztaol eus an nikotinamid N-metiltransferaz (un enzim a gatalize treuzkas ar strolladoù metil eus S-adenosylmetionine d'an nikotinamid) d'ar fibroblastoù ha d'ar c'helligoù tumor. War an dachenn arc'hwel e vez broudet ar c'helligoù T gant MNA da skarzhañ ar sitokin a brodu ar c'hrign-bev ar faktor nekroz ar c'hrign-bev alfa. Dre-se e kemer perzh an MNA tennet eus TME e reoliñ an emzalc'h eus ar c'helligoù T hag e talvez da bal an imunoterapiezh evit tretañ ar c'hrign-bev denel.
Ar metabolitoù tennet eus ar c'hrign-bev a c'hell kaout un efed harzañ pouezus war an emzalc'h enep-c'hrign-bev, ha muioc'h-mui a brouennoù a ziskouez e c'hellont bezañ un nerzh pennañ evit mont war-raok ar c'hleñved (1). Ouzhpenn efed Warburg ez eus bet kroget gant labourioù nevez evit termeniñ stad metabolek ar c'helligoù tumorel hag o darempred gant stad emzalc'h ar mikroendro tumorel (TME). Studioù war patromoù logod ha kelligoù T mab-den o deus diskouezet e c'hall ar metabolism glutamin (2), ar metabolism oksidativel (3) hag ar metabolism glukoz (4) ober dizalc'h war isstrolladoù kelligoù difenn liesseurt. Meur a metabolit en hentoù-se a harz ouzh arc'hwel enep-tumor ar c'helligoù T. Prouet eo bet e c'hall stankañ ar c'hoenzim tetrahidrobiopterin (BH4) gwallañ lieskementiñ ar c'helligoù T, ha kresk BH4 er c'horf a c'hall kreñvaat ar respont emzalc'h enep-tumor mediaet gant CD4 ha CD8. Ouzhpenn-se e c'haller saveteiñ efed immunosupresour ar kynurenine dre reiñ BH4 (5). E-barzh ar glioblastoma mutant isocitrate dehydrogenase (IDH) e vez harzet gant ar sekredur enantiometabolek (R)-2-hidroksiglutarat (R-2-HG) an aktivadur, ar c'hresk hag an obererezh sitoliz eus ar c'helligoù T (6). Nevez zo eo bet diskouezet e vez produet ar metilglioksal, un isprodu eus ar glikoliz, gant kelligoù gwaskañ a orin mieloid, ha treuzkas metilglioksal dre gelligoù T a c'hell harzañ arc'hwel ar c'helligoù T efedus. E-pad an tretañ e c'hall neutralizadur ar metilglioksal trec'hiñ war obererezh ar c'helligoù mougañ deveret eus ar myeloid (MDSC) ha gwellaat en un doare sinergiek an terapi blokañ poentoù kontroll e patromoù logod (7). Ar studiadennoù-se a laka pouez a-gevret war perzh pennañ ar metabolitoù tennet eus TME evit reoliañ arc'hwel hag obererezh ar c'helligoù T.
Disfonksion ar c'helligoù T a zo bet danevellet kalz e krign-bev an ovarioù (8). Se zo kaoz evit ul lodenn d'ar perzhioù metabolek a zo e-barzh an hipoksiezh hag ar gwazhied tumorel direizh (9), ar pezh a laka ar glukoz hag an triptofan da dreuzfurmiñ e isproduioù evel an asid laktek hag ar c'hinurenin. Laktat estregeltiek re vras ​​a zigresk ar produadur interferon-γ (IFN-γ) hag a laka an diforc'hidigezh etre isstrolladoù myelosupresour da vont war-raok (10, 11). Ar gounezerezh triptofan a harz war-eeun lieskementiñ ar c'helligoù T hag a harz ouzh ar sinaladur eus ar resever kelligoù T (12-14). Daoust d'an evezhiadennoù-se e oa bet kaset da benn kalz a labour tro-dro d'ar metabolism emzalc'h e sevenadur ar c'helligoù T in vitro dre implijout mediaoù gwellaet, pe bevennet da batromoù logod heñvel in vivo, ha hini ebet anezho ne ziskouez penn-da-benn disheñvelder ar c'hrign-bev denel hag an endro makro ha mikro fiziologel.
Un elfenn stank eus ar c'hrign-bev eus an ovarioù eo ar skignadur peritoneal hag an askitez. Ar c'hrouiñ liñvennoù kelligoù en askit a zo liammet ouzh ur c'hleñved araokaet hag ur prognoz fall (15). Hervez ar c'heloù eo hipoksiek ar c'hompartimant dibar-se, en deus liveoù uhel a faktor kresk endoteliel gwazhiedel (VEGF) hag a indoleamin 2,3-dioksigenaz (IDO), hag enframmet eo gant kelligoù reoliañ T ha kelligoù harz mieloid (15-18). Endro metabolek an askit a c'hell bezañ disheñvel diouzh hini an tumor e-unan, setu n'eo ket sklaer adprogrammiñ ar c'helligoù T en egor peritoneal. Ouzhpenn-se, an diforc'hioù pennañ hag an diforc'hioù etre an askited hag ar metabolitoù a gaver en endro tumorel a c'hellfe harzañ an enframmadur eus ar c'helligoù difenn hag o arc'hwel war an tumoroù, ha ret eo ober muioc'h a enklaskoù.
Evit diskoulmañ ar gudennoù-se hon eus savet un doare dispartiañ kelligoù kizidik ha spektrometriezh tolz dre gromatografiezh liñvel (LC-MS/MS) evit studiañ seurtoù kelligoù disheñvel (en o zouez ar c'helligoù T CD4 + ha CD8 +) hag ivez e-barzh hag etre ar c'hrign-bev. Implijout a reomp an doare-se asambles gant ar sitometriezh dre red uhel-dimensionel hag an heuliañ ARN unkellig (scRNA-seq) evit reiñ ur poltred diskoulmet-kenañ eus stad metabolek ar poblañsoù pennañ-se. An doare-se a ziskouezas ur c'hresk bras e live 1-metilnikotinamid (MNA) e kelligoù T ar tumor, hag an arnodoù in vitro a ziskouezas ne oa ket anavezet a-raok efed immunomodulañ an MNA war arc'hwel ar c'helligoù T. Dre vras ​​e tiskouez an doare-se an etregweredoù metabolek etre ar c'hrign-bev hag ar c'helligoù difenn, hag e kinnig titouroù dibar war ar metabolitoù reoliañ an difenn, a c'hell bezañ talvoudus evit tretañ an imunoterapiezh kankr an ovarioù diazezet war ar c'helligoù T.
Implijet hon eus ar c'hitometriezh dre red uhel evit muzuliañ war un dro ar c'hementad glukoz [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) hag an obererezh mitokondriek [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (MT DR, 2017, 2019) a zo war un dro merkoù stank a ziforc'h ar c'helligoù difenn hag ar poblañsoù kelligoù tumorel (Taolenn S2 ha Skeudenn S1A). Diskouezet en deus an dielfennadur-mañ e vez muioc'h a glukoz gant an askit hag ar c'helligoù tumor, met diforc'hioù bihanoc'h o deus en obererezh mitokondriel. Ar glukoz keitat a vez kemeret gant ar c'helligoù tumorel [CD45-EpCAM (EpCAM)+] a zo teir pe beder gwech muioc'h eget hini ar c'helligoù T, hag ar c'hementad glukoz keitat a vez kemeret gant ar c'helligoù T CD4 + a zo 1,2 gwech hini ar c'helligoù CD8 + T, ar pezh a ziskouez ez eus ezhommoù metabolek disheñvel gant al linfosited enfiltrañ tumorel (TIL) zoken er memes skeudenn T (Skeudenn 1). Er c'hontrol, obererezh mitokondriel ar c'helligoù tumorel a zo heñvel ouzh hini ar c'helligoù T CD4 +, hag obererezh mitokondriel an daou seurt kelligoù a zo uheloc'h eget hini ar c'helligoù T CD8 + (Skeudenn 1B). Dre vras ​​e tiskouez an disoc'hoù-se al live metabolek. Uheloc'h eo obererezh metabolek ar c'helligoù tumorel eget hini ar c'helligoù CD4 + T, hag obererezh metabolek ar c'helligoù CD4 + T zo uheloc'h eget hini ar c'helligoù CD8 + T. Daoust d'an efedoù-se etre ar seurtoù kelligoù, n'eus diforc'h kempoell ebet e statud metabolek ar c'helligoù CD4 + ha CD8 + T pe o c'hementadoù keñverel en askit e-keñver ar c'hrign-bev (Skeudenn 1C). Er c'hontrol, er fraksion kelligoù CD45, e oa kresket ar c'hementad a gelligoù EpCAM+ er c'hrign-bev e-keñver an askit (Skeudenn 1D). Gwelet hon eus ivez un diforc'h metabolek sklaer etre elfennoù ar c'helligoù EpCAM+ hag EpCAM-. Ar c'helligoù EpCAM+ (tumor) o deus muioc'h a glukoz hag a obererezh mitokondriel eget ar c'helligoù EpCAM-, ar pezh a zo kalz uheloc'h eget obererezh metabolek ar fibroblastoù e kelligoù tumor e TME (Skeudenn 1, E ha F).
(A ha B) Kreñvder ar fluoresañs (MFI) eus an adkempenn glukoz (2-NBDG) (A) hag obererezh mitokondriel ar c'helligoù T CD4 + (MitoTracker ruz teñval) (B) Grafoù arouezius (kleiz) ha roadennoù taolennet (Dehou), kelligoù T CD8 + ha kelligoù EpCAM + CD45-tumorel eus ar c'helligoù tumorel ha tumor. (C) Ar c'heñver etre ar c'helligoù CD4 + ha CD8 + (eus ar c'helligoù CD3 + T) en askit hag en tumor. (D) Kementad ar c'helligoù tumor EpCAM + en askit hag en tumor (CD45−). (E ha F) EpCAM + CD45-tumor ha EpCAM-CD45-matris glukoz (2-NBDG) (E) hag obererezh mitokondriek (MitoTracker ruz teñval) (F) grafikoù dileuriad (kleiz) ha roadennoù taolennet (Dehou) Ascites ha kelligoù tumor. (G) Grafoù arouezius eus an eztaol CD25, CD137 ha PD1 dre sitometriezh ar red. (H ha I) eztaol CD25, CD137 ha PD1 war ar c'helligoù T CD4 + (H) ha kelligoù T CD8 + (I). (J ha K) Fenotipoù naïv, memor kreiz (Tcm), memor efedus (Teff) ha memor efedus (Tem) diazezet war eztaol CCR7 ha CD45RO. Skeudennoù arouezius (kleiz) ha roadennoù taolennoù (dehou) eus kelligoù T CD4 + (J) ha kelligoù T CD8 + (K) en askit hag en tumoroù. Talvoudoù P termenet dre arnodenn t par (*P<0,05, **P<0,01 ha ***P<0,001). Ar linenn a zastum ar c'hlañvidi heñvel (n = 6). FMO, fluoresañs hep unan ; MFI, kreñvder kreiz ar fluoresañs.
An analizoù all a ziskouezas diforc'hioù pouezus all etre ar statud fenotipek kelligoù T diskoulmet-tre. Ar memor gweredekaet (Skeudenn 1, G da I) hag ar memor efedus (Skeudenn 1, J ha K) er c'hrign-bev a zo kalz muioc'h a-wechoù eget an ascites (kenfeur ar c'helligoù CD3 + T). Heñvel, o dielfennañ ar fenotipoù dre eztaol ar merkoù aktivadur (CD25 ha CD137) hag ar merkoù diskar [protein marv ar c'helligoù programmet 1 (PD1)] a ziskouezas, daoust ma'z eo disheñvel perzhioù metabolek ar poblañsoù-se (Skeudenn S1, B betek E), met ne oa bet gwelet diforc'hioù metabolek pouezus ebet etre an efedoù naiv, pe an isstrollad memor (Skeudenn S1, F1 ME). Kadarnaet e oa bet an disoc'hoù-se dre implijout doareoù deskiñ dre ardivink evit lakaat fenotipoù ar c'helligoù ent emgefre (21), ar pezh a ziskouezas ivez bezañs un niver bras a gelligoù mell-eskern (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) en askit ar c'hlañvour (Skeudenn S2A ). E-touez an holl seurtoù kelligoù anavezet, ar boblañs kelligoù myeloid-mañ a ziskouezas ar muiañ a glukoz hag a obererezh mitokondriel (Skeudenn S2, B betek G). An disoc'hoù-se a laka war wel an diforc'hioù metabolek kreñv etre ar seurt kelligoù lies a gaver en askit hag en tumoroù e-touez ar c'hlañvidi HGSC.
Ar gudenn bennañ evit kompren perzhioù metabolomek an TIL eo an ezhomm da ziforc'hañ skouerennoù kelligoù T a glannder, a c'halloud hag a c'hantved a-walc'h diouzh an tumoroù. Studioù diwezhañ o deus diskouezet e c'hall an doareoù renkañ ha pinvidikaat ar perlennoù diazezet war ar c'hitometriezh dre red kas da gemmoù e profiloù ar metabolitoù kelligel (22-24). Evit trec'hiñ ar gudenn-se hon eus gwellaet an doare pinvidikaat perlez evit distagañ ha distagañ TIL diouzh krign-bev an ovarioù denel tennet dre surjianerezh a-raok an dielfennañ dre LC-MS/MS (gwelet Dafar ha Doareoù ; Skeudenn 2A). Evit priziañ efed hollek ar c'homenad-mañ war ar c'hemmoù metabolit, hon eus keñveriet profiloù metabolit ar c'helligoù T bet gweredekaet gant donezonerien yac'h goude ar pazenn dispartiañ perlez meneget a-us gant kelligoù na oant ket bet dispartiet perlez met chomet war skorn. An dielfennadur kontroll kalite-mañ en deus kavet ez eus ur c'heñveriañ uhel etre an div stad-se (r = 0,77), hag e oa uhel adlavaret teknikel ar strollad 86 metabolit (Skeudenn 2B). Dre-se e c'hall an doareoù-se ober un dielfennadur reizh eus ar metabolitoù e kelligoù a zo o vont da binvidikaat ar seurt kelligoù, o kinnig evel-se ar bladenn gentañ uhel-disoc'h evit anavezout metabolitoù resis en HGSC, o reiñ an tu d'an dud da gaout ur c'homprenadenn donoc'h eus ar programm metabolism reizhel.
(A) Skeudenn skematikel pinvidikaat ar perlez magnetek. A-raok an dielfennadur dre LC-MS/MS e vo treuzkaset ar c'helligoù teir dro war-lerc'h pinvidikaat gant perlennoù magnetek pe chom a raio war ar skorn. (B) Efed ar seurt pinvidikaat war niver ar metabolitoù. Keitat teir muzuliadenn evit pep seurt pinvidikaat ± SE. Ar linenn gris a zastum un darempred 1:1. Ar c'heñveriadur etre-rummad (ICC) eus ar muzulioù adlavaret diskouezet e tikedenn an ahel. NAD, nikotinamid adenin dinukleotid. (C) Skeudenn skematek eus mont en-dro an dielfennadur eus ar metabolitoù klañv. Dastumet e vez an askited pe an tumoroù digant ar c'hlañvidi ha kriopreservet. Un tamm bihan eus pep skouerenn a oa bet dielfennet dre red sitometriezh, tra ma oa bet graet teir ront pinvidikaat gant ar skouerennoù all evit ar c'helligoù CD4+, CD8+ ha CD45-. An tammoù kelligoù-se a oa bet dielfennet dre LC-MS/MS. (D) Kartenn tommder ar boued metabolitoù skoueriekaet. An dendrogramm a zastum strollañ Ward ar pellderioù euklidean etre ar skouerennoù. (E) Analizañ elfennoù pennañ (PCA) kartenn ar metabolitoù skouerenn, o tiskouez teir eiladenn eus pep skouerenn, skouerennoù eus ar memes klañv a zo liammet gant ul linenn. (F) PCA ar profil metabolit eus ar skouerenn lakaet war ar c'hlañvour (da lâret eo, dre implijout un adlavarenn rannel); bevennet eo ar seurt skouerenn gant ar c'horf konveks. PC1, elfenn bennañ 1; PC2, elfenn bennañ 2.
Da c'houde, hon eus implijet an doare pinvidikaat-mañ evit dielfennañ 99 metabolit er fraksionoù kelligoù CD4 +, CD8 + ha CD45 en ascites ha tumoroù kentañ c'hwec'h klañvdiour HGSC (Skeudenn 2C, Skeudenn S3A ha Taolenn S3 ha S4). Ar boblañs a denn d'ar c'hoant a ya d'ober 2% da 70% eus ar skouerenn vras ​​orin a gelligoù bev, ha disheñvel-tre eo ar c'hementad kelligoù etre ar c'hlañvidi. Goude bezañ dispartiet ar perlez, ar fraksion pinvidikaet a bouez (CD4+, CD8+ pe CD45-) a ya d'ober ouzhpenn 85% eus an holl gelligoù bev er skouerenn dre vras. An doare pinvidikaat-mañ a ro tro deomp da zielfennañ poblañsoù kelligoù diwar metabolism gwiadoù tumor mab-den, ar pezh n'eo ket posupl ober diwar skouerennoù bras. Dre implijout ar protokol-mañ hon eus termenet e oa l-kynurenine hag adenozin, an daou metabolit immunosupresour-se, a oa bet termenet mat, uhelaet e kelligoù T tumor pe kelligoù tumor (Skeudenn S3, B ha C). Dre-se e tiskouez an disoc'hoù-se fealded ha barregezh hon teknologiezh dispartiañ kelligoù ha spektrometriezh tolz da gavout metabolitoù pouezus biologel e gwiadoù ar c'hlañvidi.
Diskouezet en deus hor studiadenn ivez un disparti metabolek kreñv eus ar seurt kelligoù e-barzh hag etre ar c'hlañvidi (Skeudenn 2D ha Skeudenn S4A). Dreist-holl, e-keñver ar c'hlañvidi all, e tiskoueze ar c'hlañvour 70 perzhioù metabolek disheñvel (Skeudenn 2E ha Skeudenn S4B), ar pezh a ziskouez e c'hallfe bezañ un diforc'h metabolek bras etre ar c'hlañvidi. Ret eo merkañ e oa bihanoc'h ar c'hementad askit dastumet gant ar c'hlañvour 70 (80 ml) e-keñver ar c'hlañvidi all (1,2 da 2 litrad; Taolenn S1). Ar c'hontroll eus an heterogeniezh etre ar c'hlañvidi e-pad an analizenn elfennoù pennañ (da skouer, dre implijout an analizenn redundañs rannel) a ziskouez kemmoù kempoell etre ar seurtoù kelligoù, hag ar seurtoù kelligoù ha/pe ar mikroendro a zo bodet splann hervez ar profil metabolit (Skeudenn 2F ). An analizenn eus metabolitoù hepken a lakaas pouez war an efedoù-se hag a ziskouezas diforc'hioù pouezus etre ar seurt kelligoù hag ar mikroendro. Ret eo merkañ eo an diforc'h brasañ a vez gwelet an MNA, a vez pinvidikaet peurliesañ e kelligoù CD45- hag e kelligoù CD4+ ha CD8+ a dremen dre ar c'hrign-bev (Skeudenn 3A). Evit ar c'helligoù CD4 + eo an efed-se anatañ, hag an MNA er c'helligoù CD8 + a seblant bezañ gwall levezonet gant an endro ivez. Koulskoude, n'eo ket pouezus, rak tri c'hlañvour hepken eus ar c'hwec'h a c'hell bezañ priziet evit ar poentoù CD8+ tumorel. Ouzhpenn an MNA, e seurtoù kelligoù disheñvel en ascites hag en tumoroù, e vez pinvidik disheñvel ivez metabolitoù all a zo fall-tre e TIL (Skeudennoù S3 ha S4). Dre-se e tiskouez ar roadennoù-se un hollad metabolitoù imunomodulañ prometet evit enklaskoù pelloc'h.
(A) Danvez normalaet an MNA e kelligoù CD4+, CD8+ ha CD45- diwar an askit hag an tumor. Ar grafik dre voest a ziskouez ar c'hreiz (linenn), ar c'hementad etrekartilel (charnier ar framm) hag ar c'hementad roadennoù, betek 1,5 gwech ar c'hementad etrekartilel (mousc'hoarzh ar framm). Evel deskrivet e Dafar ha doareoù ar c'hlañvour, implijit talvoud limma ar c'hlañvour evit termeniñ talvoud P (*P<0.05 ha **P<0.01). (B) Skeudenn skematikel eus metabolegezh an MNA (60). Metabolitoù : S-adenosyl-1-metionine ; SAH, S-adenozin-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-metil- 2-piridon-5-karboksamid ; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamid ; NR, nikotinamid riboz ; NMN, mononukleotid nikotinamid. Enzimoù (glas) : NNMT, nikotinamid N-metiltreuzkas ; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehid oksidaz 1; NRK, nikotinamid ribozid kinaz ; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, nukleozid fosforilaz purin. (C) t-SNE eus scRNA-seq an ascites (gris) hag ar c'hrign-bev (ruz; n = 3 klañvdiour). (D) eztaol NNMT e poblañsoù kelligoù disheñvel anavezet dre implijout scRNA-seq. (E) Eztaol NNMT hag AOX1 e SK-OV-3, 293T eus an divgell embrionel denel (HEK), kelligoù T ha kelligoù T tretet gant MNA. Diskouezet eo an eztaol pleget e-keñver SK-OV-3. Diskouezet eo ar patrom eztaol gant SEM (n = 6 donezon yac'h). Talvoudoù Ct brasoc'h eget 35 a vez sellet outo evel dizoloet (UD). (F) Eztaol SLC22A1 ha SLC22A2 e SK-OV-3, HEK293T, kelligoù T ha kelligoù T tretet gant 8mM MNA. Diskouezet eo an eztaol pleget e-keñver SK-OV-3. Diskouezet eo ar patrom eztaol gant SEM (n = 6 donezon yac'h). Talvoudoù Ct brasoc'h eget 35 a vez sellet outo evel dizoloet (UD). (G) Danvez MNA ar c'helligoù e kelligoù T yac'h donezonet gweredekaet goude 72 eurvezh enkubadur gant MNA. Diskouezet eo ar patrom eztaol gant SEM (n = 4 donezon yac'h).
Produet e vez MNA dre dreuzkas ar strollad metil eus S-adenosyl-1-metionine (SAM) da nicotinamide (NA) dre nicotinamide N-metiltransferaz (NNMT; Skeudenn 3B). NNMT a zo dreist-esprimet e meur a seurt krign-bev mab-den hag a zo liammet ouzh ar c'hrouiñ, an aloubadeg hag ar metastazennoù (25-27). Evit kompren gwelloc'h orin an MNA e kelligoù T e TME, hon eus implijet scRNA-seq evit termeniñ an eztaol NNMT a-hed ar seurt kelligoù en ascites ha tumoroù tri c'hlañvour HGSC (Taolenn S5). An dielfennadur war-dro 6 500 kellig a ziskouezas e oa bevennet an eztaol NNMT d'ar poblañsoù kelligoù fibroblast ha tumor (Skeudenn 3, C ha D). Ret eo merkañ n'eus eztaol NNMT anat ebet e poblañs ebet a eztaol PTPRC (CD45 +) (Skeudenn 3D ha Skeudenn S5A), ar pezh a ziskouez eo bet lakaet an MNA detektet er spektrum metabolit e-barzh ar c'helligoù T. An eztaol aldehid oksidaz 1 (AOX1) a dreuzfurm an MNA e 1-metil-2-piridon-5-karboksamid (2-PYR) pe 1-metil-4-piridon-5-karboksamid (4-PYR); Skeudenn 3B) a zo ivez bevennet d'ar boblañs fibroblastoù a eztaol COL1A1 (Skeudenn S5A), ar pezh a ziskouez asambles n'eus ket gant ar c'helligoù T ar galloud da vetabolism MNA hengounel. Gwiriekaet e oa bet patrom eztaol ar genoù liammet ouzh an MNA-se dre implijout un eil strollad roadennoù kelligoù dizalc'h eus ascites eus klañvidi HGSC (Skeudenn S5B; n = 6) (16). Ouzhpenn-se, an dielfennadur dre enkadenn polimeraz kementadel (qPCR) eus kelligoù T donezonerien yac'h tretet gant MNA a ziskouezas e oa NNMT pe AOX1 tost da vezañ eztaolet e-keñver kelligoù tumor an ovarioù SK-OV-3 kontroll (Skeudenn 3E). An disoc'hoù dic'hortoz-se a ziskouez e c'hall MNA bezañ skarzhet eus fibroblastoù pe tumoroù e kelligoù T tost en TME.
Daoust ma vez kavet e-touez ar c'hannaded ar familh treuzdougerien kationoù organek 1 da 3 (OCT1, OCT2 hag OCT3) kodet gant ar familh treuzdougerien dizoloet 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 ha SLC22A3), n'eo ket termenet c'hoazh an treuzdougerien a c'hallfe bezañ MNA (28) . QPCR mRNA eus kelligoù T donezonerien yac'h a ziskouezas liveoù eztaol izel eus SLC22A1 met liveoù dizoloet eus SLC22A2, ar pezh a gadarnaas e oa bet embannet a-raok el lennegezh (Skeudenn 3F) (29). Er c'hontrol, al linenn gelligoù tumor ovariek SK-OV-3 a ziskoueze liveoù uhel eus an daou dreuzdouger (Skeudenn 3F).
Evit testeniañ hag-eñ e c'hallfe ar c'helligoù T kaout ar galloud da sunañ MNA estren e voe sevenet kelligoù T donezonerien yac'h e-pad 72 eurvezh e-kichen kementadoù disheñvel a MNA. Pa n'eus ket MNA diavaez, ne c'haller ket detektiñ endalc'had kelligel an MNA (Skeudenn 3G). Koulskoude, ar c'helligoù T aktivet tretet gant MNA eksogen a ziskouezas ur c'hresk diouzh ar c'hementad en endalc'had MNA er c'helligoù, betek 6 mM MNA (Skeudenn 3G). Diskouez a ra an disoc'h-mañ e c'hall TIL kemer MNA c'hoazh, daoust d'al live izel a eztaol treuzdouger ha d'an diouer a enzim pennañ karget eus metabolism an MNA e-barzh ar c'helligoù.
Spektrum ar metabolitoù e kelligoù T ar c'hlañvidi hag an arnodoù sugnañ MNA in vitro a gresk ar c'hoant da skarzhañ MNA gant ar fibroblastoù liammet ouzh ar c'hrign-bev (CAF) ha gallout a ra ar c'helligoù tumor reoliañ fenotip ha fonksion TIL. Evit termeniñ efed an MNA war ar c'helligoù T e voe gweredekaet ar c'helligoù T donezonerien yac'h in vitro e-barzh pe hep MNA, ha priziet e voe o lieskementiñ hag o produiñ sitokinoù. Goude 7 devezh ouzhpennañ MNA d'ar c'hementad uhelañ e oa bet digresket a-feson an niver a doubladur poblañs, tra ma oa bet miret ar nerzh en holl c'hementadoù (Skeudenn 4A). Ouzhpenn-se, an tretañ gant MNA diavaez a lakaas kreskiñ ar c'hementad a gelligoù T CD4 + ha CD8 + a eztaol faktor nekroz tumor-α (TNFα; Skeudenn 4B). Er c'hontrol, ar produadur etrekellig IFN-γ a oa digresket kalz e kelligoù T CD4 +, met pas e kelligoù T CD8 +, ha ne oa kemm pouezus ebet en interleukin 2 (IL-2; Skeudenn 4, C ha D). Dre-se, an analizenn immunosorbent liammet ouzh an enzimoù (ELISA) eus ar supernatantoù eus ar sevenadurioù kelligoù T tretet gant MNA-se a ziskouezas ur c'hresk pouezus e TNFα, un digresk en IFN-γ, ha ne oa ket bet kemmet en IL-2 (Skeudenn 4, E da G). . Digresk an IFN-γ a ziskouez e c'hall MNA c'hoari ur roll evit harzañ obererezh enep-tumor ar c'helligoù T. Evit simulañ efed an MNA war ar c'hitotoksisite dre gelligoù T e vez produet gant kelligoù mononukleel gwad tro-dro yac'h (PBMC) kelligoù degemerer antigen T (FRα-CAR-T) kimerik a denn d'ar resever folat α ha CAR-T (GFP) reoliet gant kelligoù protein fluoreskant glas (GFP) -CAR-T). Sevenet e voe ar c'helligoù CAR-T e-pad 24 eurvezh e-kichen MNA, ha goude-se e voe kensevenet gant kelligoù tumor an ovarioù SK-OV-3 denel o ezteurel ar resever folat α en ur feur efedour-tarzh a 10:1. An tretañ MNA a lakaas un digresk bras en obererezh lazhañ ar c'helligoù FRα-CAR-T, ar pezh a oa heñvel ouzh ar c'helligoù FRα-CAR-T tretet gant adenozin (Skeudenn 4H).
(A) Niver hollek ar c'helligoù bev ha doubladur ar boblañs (PD) war-eeun diwar ar sevenadur d'an deiz 7. Ar grafik barrennoù a zastum ar geidenn + SEM eus c'hwec'h donezon yac'h. Diskouez a ra roadennoù eus n = 3 arnod dizalc'h da nebeutañ. (B da D) CD3/CD28 hag IL-2 a voe implijet evit gweredekaat ar c'helligoù T en o c'hementad MNA e-pad 7 devezh. A-raok an dielfennadur e voe broudet ar c'helligoù gant PMA/ionomycin gant GolgiStop e-pad 4 eurvezh. eztaol TNFα (B) e kelligoù T. Skeudenn skouer (kleiz) ha roadennoù taolennek (dehou) eus eztaol TNFα e kelligoù bev. eztaol IFN-γ (C) hag IL-2 (D) e kelligoù T. Muzuliañ a reer an eztaol sitokinoù dre sitometriezh ar red. Ar grafik barrennoù a zastum ar geidenn (n = 6 donezon yac'h) + SEM. Implijout an analizenn un tu eus ar varregezh hag ar muzulioù adlavaret (*P<0.05 ha **P<0.01) evit termeniñ ar werzh P. Diskouez a ra roadennoù eus n = 3 arnod dizalc'h da nebeutañ. (E da G) CD3/CD28 hag IL-2 a voe implijet evit lakaat ar c'helligoù T da vont en-dro en o feur MNA e-pad 7 devezh. Dastumet e oa bet ar metou a-raok ha goude 4 eurvezh stimuladur PMA/ionomisin. Muzuliañ a reer ar c'hementadoù TNFα (E), IFN-γ (F) hag IL-2 (G) dre ELISA. Ar grafik barrennoù a zastum ar geidenn (n = 5 donezon yac'h) + SEM. Talvoudegezh P termenet dre implijout un dielfennadur unvan eus ar c'hemm ha muzulioù adlavaret (*P<0.05). Ar linenn strizh a ziskouez bevenn detektañ an detektadur. (H) Test lizis ar c'helligoù. Ar c'helligoù FRα-CAR-T pe GFP-CAR-T a voe reizhet gant adenozin (250μM) pe MNA (10 mM) e-pad 24 eurvezh, pe lezet hep bezañ tretet (Ctrl). Muzuliañ a reer dregantad lazhadeg ar c'helligoù SK-OV-3. Talvoud P termenet gant an test t Welch (*P<0,5 ha **P<0,01).
Evit kaout ur gompren mekanikel eus ar reoliñ eztaol TNFα diouzh MNA e voe priziet ar c'hemmoù e mRNA TNFα ar c'helligoù T tretet gant MNA (Skeudenn 5A). Ar c'helligoù T donezonerien yac'h tretet gant MNA o deus diskouezet ur c'hresk div wech e liveoù treuzskrivañ TNFα, ar pezh a ziskouez eo diouzh reoliadur treuzskrivañ TNFα eo MNA. Evit studiañ ar mekanik reoliañ posupl-se e voe priziet daou faktor treuzskrivañ anavezet a reol TNFα, da lâret eo ar faktor nukleel kellig T aktivet (NFAT) hag ar protein 1 spesadel (Sp1), e respont d'al liammadur MNA ouzh ar promoter TNFα tostañ ( 30). En promoter TNFα ez eus 6 lec'h liammañ NFAT anavezet ha 2 lec'h liammañ Sp1, o treuzkas en ul lec'h [-55 koublad diazez (bp) eus ar 5'cap] (30). An immunopresipitadur kromatin (ChIP) a ziskouezas pa veze tretet gant MNA e kreske teir gwech liammadur Sp1 ouzh ar bromesaer TNFα. Enkorfadur an NFAT a greskas ivez hag a dostaas ouzh ar pouez (Skeudenn 5B). Diskouez a ra ar roadennoù-se e reoli MNA eztaol TNFα dre dreuzskrivadur Sp1, hag en un doare nebeutoc'h eztaol NFAT.
(A) Keñveriet gant kelligoù T sevenet hep MNA, ar c'hemm plegañ eus an eztaol TNFα e kelligoù T tretet gant MNA. Diskouezet eo ar patrom eztaol gant SEM (n = 5 donezon yac'h). Diskouez a ra roadennoù eus n = 3 arnod dizalc'h da nebeutañ. (B) Ar promoter TNFα eus ar c'helligoù T tretet gant pe hep 8 mM MNA goude ma oa bet kendeuzet NFAT ha Sp1 gant (Ctrl) ha stimuladur PMA/ionomycin e-pad 4 eurvezh. Implijet e voe an immunoglobulin G (IgG) hag H3 evel kontrolloù negativel ha pozitivel evit an immunopresipitadur, hervez an urzh. Ar c'hantaouiñ ChIP a ziskouezas e oa kresket meur a wech liammadur Sp1 ha NFAT ouzh ar bromesaer TNFα e kelligoù tretet gant MNA e-keñver ar c'hontroll. Diskouez a ra roadennoù eus n = 3 arnod dizalc'h da nebeutañ. Talvoudegezh P termenet gant meur a test t (*** P <0.01). (C) Keñveriet gant ascites HGSC, ar c'helligoù T (nann-sitotoksik) a ziskouezas un eztaol kresket eus TNF er c'hrign-bev. Ar livioù a zastum klañvidi disheñvel. Ar c'helligoù diskouezet a zo bet skoueriekaet dre zegouezh betek 300 ha jitteret evit bevenniñ an dreisttresañ (** Padj = 0,0076). (D) Model kinniget eus an MNA evit ar c'hrign-bev eus an ovarioù. Produet e vez MNA e kelligoù tumorel ha fibroblastoù e TME ha kemeret e vez gant kelligoù T. Kreskiñ a ra MNA liammadur Sp1 ouzh ar promoter TNFα, ar pezh a gas da greskiñ an treuzskrivadur TNFα hag ar produiñ sitokinoù TNFα. MNA a laka ivez un digresk en IFN-γ. Harz ouzh arc'hwel ar c'helligoù T a gas da zigreskiñ ar galloud lazhañ ha da greskiñ ar c'hrign-bev buanoc'h.
Hervez ar c'heloù, TNFα en deus efedoù enep-tumor hag enep-tumor diouzh an tu a-raok hag an tu a-dreñv, met ur perzh anavezet mat en deus evit brudañ kresk ha metastaz ar c'hrign-bev en ovarioù (31-33). Hervez ar c'heloù eo uheloc'h ar c'hementad TNFα en askit hag er gwiadoù tumorel e-touez ar c'hlañvidi gant krign-bev an ovarioù eget e-barzh ar gwiadoù benign (34-36). Evit a sell ouzh ar mekanik e c'hall TNFα reoliañ an aktivadur, an arc'hwel hag al lieskementiñ eus ar c'helligoù gwad gwenn, ha cheñch fenotip ar c'helligoù kankr (37, 38). Hervez an disoc'hoù-se, an analizenn eztaol genel diforc'hel a ziskouezas e oa TNF reoliet kalz e kelligoù T e gwiadoù tumorel e-keñver an askit (Skeudenn 5C). Ar c'hresk en eztaol TNF ne oa gwelet nemet e poblañsoù kelligoù T gant ur fenotip nann-sitotoksik (Skeudenn S5A). Evit diverrañ, ar roadennoù-se a skoazell ar soñj ez eus gant MNA efedoù immunosupresour ha broudañ ar c'hrign-bev en HGSC.
An tikedennañ dre fluoreskans diazezet war ar c'hitometriezh dre red a zo deuet da vezañ an doare pennañ da studiañ metabolegezh an TIL. Diskouezet en deus ar studiadennoù-se e vez muioc'h a zarempredoù gant TIL ar c'hizhier hag an dud da gemer glukoz (4, 39) ha da goll tamm-ha-tamm arc'hwel ar mitokondri (19, 40) e-keñver al linfosited gwad tro-dro pe ar c'helligoù T eus organoù limfoid eilrenk. Daoust ma'z eus bet gwelet disoc'hoù heñvel er studiadenn-mañ, an diorren pennañ eo keñveriañ metabolism ar c'helligoù tumorel hag an TIL eus ar memes gwiad tumorel tennet. Heñvel ouzh lod eus an danevelloù kent-se, ar c'helligoù tumor (CD45-EpCAM +) eus an askited hag ar c'hrign-bev o deus ur c'hementad glukoz uheloc'h eget ar c'helligoù T CD8 + ha CD4 +, ar pezh a ziskouez e c'haller keñveriañ ar c'hementad glukoz uhel a vez kemeret gant ar c'helligoù tumor gant ar c'helligoù T. Mennozh ar genstrivadeg kelligoù T. TME. Koulskoude eo uheloc'h obererezh mitokondriel ar c'helligoù tumorel eget hini ar c'helligoù T CD8 +, met heñvel eo obererezh ar mitokondrioù ouzh hini ar c'helligoù T CD4 + . Kreñvaat a ra an disoc'hoù-se an tem nevez a lavar eo pouezus ar metabolism oksidativel evit ar c'helligoù tumorel (41, 42). Kinnig a reont ivez e c'hallfe ar c'helligoù T CD8 + bezañ muioc'h kizidik ouzh an direizhder oksidativel eget ar c'helligoù T CD4 +, pe e c'hallfe ar c'helligoù T CD4 + implijout fontoù karbon all eget ar glukoz evit mirout an obererezh mitokondriel (43, 44). Ret eo merkañ n'hon eus gwelet diforc'h ebet e-keñver an degemer glukoz pe an obererezh mitokondriel etre an efedoù CD4 + T, ar memor T an efedoù hag ar c'helligoù memor kreiz T en askit. Heñvel, stad diforc'hidigezh ar c'helligoù CD8 + T er c'hrign-bev n'en deus netra da welet gant ar c'hemmoù en adtapout glukoz, ar pezh a laka war wel an diforc'h pouezus etre ar c'helligoù T sevenet in vitro hag an TIL denel in vivo (22). Kadarnaet e oa bet an evezhiadennoù-se ivez gant implij un dasparzh poblañs kelligoù emgefre hep tu, ar pezh a ziskouezas ivez e oa ar c'helligoù CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + gant ur c'hementad glukoz uheloc'h hag un obererezh mitokondriel uheloc'h eget ar c'helligoù tumor met o deus ur boblañs kelligoù oberiant metabolek. Ar boblañs-se a c'hellfe bezañ an ispoblañs soñjet a gelligoù gwaskañ mieloid pe kelligoù dendritek plasmasitoid anavezet en dielfennadur scRNA-seq. Daoust ma'z eus bet kavet an daou dra-se e tumoroù an ovarioù denel [45], ezhomm o deus c'hoazh. Labour all a zo evit deskrivañ an ispoblañs myeloid-se.
Daoust ma c'hall an doareoù diazezet war ar sitometriezh dre red sklaeraat an diforc'hioù hollek e-keñver ar glukoz hag ar metabolism oksidativel etre ar seurtoù kelligoù, n'eo ket bet termenet c'hoazh ar metabolitoù resis produet gant ar glukoz pe gant fontoù karbon all evit ar metabolism mitokondriel e TME. Evit reiñ bezañs pe ezvezañs metabolitoù d'un isstrollad TIL roet e ranker puraat ar boblañs kelligoù diouzh ar gwiad tennet. Dre-se e c'hall hor meziant pinvidikaat kelligoù asambles gant ar spektrometriezh tolz reiñ titouroù diwar-benn ar metabolitoù a vez pinvidikaet en un doare disheñvel e kelligoù T ha poblañsoù kelligoù tumorel e skouerennoù klañvidi a glot. Daoust ma'z eus gounidoù gant an doare-se e-keñver renkañ ar c'helligoù gweredekaet gant ar fluoresañs, e c'hall levraouegoù metabolitoù zo bezañ gwallet abalamour d'o stabilded diazez ha/pe d'o feur treuzkas buan (22). Koulskoude, hon doare-ober a oa deuet a-benn da anavezout daou metabolit immunosupresour anavezet, an adenozin hag ar c'hinurenin, rak disheñvel-tre int etre ar seurtoù skouerennoù.
Hon dielfennadur metabolomek eus an tumoroù hag eus an isdoareoù TIL a ginnig muioc'h a ditouroù diwar-benn perzh ar metabolitoù e TME an ovarioù. Da gentañ, dre implijout ar sitometriezh dre red, hon eus termenet ne oa diforc'h ebet etre an tumoroù hag ar c'helligoù CD4 + T en obererezh mitokondriek. Koulskoude, an analizenn LC-MS/MS a ziskouezas kemmoù pouezus e niver ar metabolitoù e-touez ar boblañsoù-se, ar pezh a ziskouez e ranker displegañ gant evezh an disoc'hoù diwar-benn ar metabolism TIL hag e obererezh metabolek dre vras. Da eil, MNA eo ar metabolit gant an diforc'h brasañ etre ar c'helligoù CD45 hag ar c'helligoù T en askit, ha n'eo ket en tumoroù. Dre-se e c'hall ar c'hompartimantadur hag al lec'hiadur tumor kaout efedoù disheñvel war metabolegezh an TIL, ar pezh a laka war wel an disheñvelder a c'hallfe bezañ en ur mikroendro resis. Da drede, eztaol an enzim produiñ MNA NNMT a zo bevennet dreist-holl da CAF, a zo kelligoù tumor en un doare nebeutoc'h, met liveoù MNA a c'haller detektiñ a vez gwelet e kelligoù T tennet eus tumor. An dreist-emzalc'h eus NNMT e CAF an ovarioù en deus un efed brudet evit brudañ ar c'hrign-bev, evit ul lodenn abalamour da broduiñ metabolism ar CAF, da aloubadeg ar tumor ha d'ar metastazennoù (27). Daoust ma'z eo etre live hollek an TIL, eo liammet-tre an eztaol NNMT e CAF ouzh an isdoare mezenkimel Cancer Genome Atlas (TCGA), a zo liammet gant ur prognoz fall (27, 46, 47). Erfin, eztaol an enzim AOX1 karget eus diskar an MNA a zo bevennet ivez d'ar boblañs CAF, ar pezh a ziskouez n'eus ket a c'halloud gant ar c'helligoù T da vetaboliñ an MNA. An disoc'hoù-se a skoazell ar soñj, daoust ma vez ezhomm da labourat muioc'h evit gwiriañ an disoc'h-se, e c'hallfe liveoù uhel a MNA e kelligoù T diskouez bezañs ur mikroendro CAF imunosupresour.
Pa seller ouzh live izel eztaol an treuzdougerien MNA ha liveoù dizoloet ar proteinoù pennañ a gemer perzh e metabolism an MNA, n'eo ket gortozet bezañs MNA e kelligoù T. Ne c'haller ket detektiñ NNMT nag AOX1 dre an analizenn scRNA-seq ha dre qPCR tarzhet eus daou strollad dizalc'h. Diskouez a ra an disoc'hoù-se ne vez ket sintezet an MNA gant ar c'helligoù T, met lonket gant an TME tro-dro. Arnodennoù in vitro a ziskouez e vez tu d'ar c'helligoù T dastum MNA diavaez.
Diskouezet en deus hor studiadennoù in vitro e vez broudet an MNA diavaez da eztaol TNFα e kelligoù T hag e vez kreñvaet liammadur Sp1 ouzh ar bromesaer TNFα. Daoust ma 'z eus gant TNFα arc'hwelioù enep-tumor hag enep-tumor, e krign-bev an ovarioù e c'hall TNFα broudañ kresk kankr an ovarioù (31-33). Neptuelaat TNFα e sevenadur kelligoù tumor an ovarioù pe diverkañ ar sinal TNFα e patromoù logod a c'hell gwellaat ar produiñ sitokinoù enflammus dre TNFα ha harzañ kresk ar tumor (32, 35). Dre-se, er c'has-mañ, e c'hall an MNA deveret eus TME ober evel ur metabolit pro-enflammus dre ur mekanik diouzh TNFα dre ar boukl autokrin, o broudañ evel-se donedigezh ha skignañ kankr an ovarioù (31). Diazezet war ar c'hementad-se e vez studiet ar blokadenn TNFα evel un elfenn terapeutek a c'hallfe bezañ evit ar c'hrign-bev en ovarioù (37, 48, 49). Ouzhpenn-se e vez gwanaet gant MNA sitotoksisite ar c'helligoù CAR-T ouzh ar c'helligoù tumor ovariek, ar pezh a ginnig muioc'h a brouennoù evit ar mougañ emzalc'h dre MNA. A-gevret, an disoc'hoù-se a ginnig ur patrom ma vez skarzhet MNA gant ar c'hrign-bev hag ar c'helligoù CAF e-barzh TME estregeltiek. Dre (i) stimuladur kresk kankr an ovarioù broudet gant TNF ha (ii) harz ouzh obererezh sitotoksikel ar c'helligoù T broudet gant MNA e c'hallfe kaout un efed tumor doubl (Skeudenn 5D).
Evit echuiñ, dre lakaat da dalvezout ur meskaj pinvidikaat buan ar c'helligoù, heuliañ kelligoù unvan ha profilañ metabolek, e oa bet diskuliet gant ar studiadenn-mañ an diforc'hioù imunometabolomek bras etre ar c'hrign-bev hag ar c'helligoù askit e-touez ar c'hlañvidi HGSC. An dielfennadur klok-mañ a ziskouezas e oa diforc'hioù e-keñver an degemer glukoz hag an obererezh mitokondriel etre ar c'helligoù T, hag anavezet e oa bet an MNA evel ur metabolit reoliañ emzalc'h nann-gellig. Ar roadennoù-se o deus un efed war an doare ma vez levezonet metabolism ar c'helligoù T gant an TME e krign-bev an dud. Daoust ma'z eus bet danevellet ar genstrivadeg reizh evit ar boued etre ar c'helligoù T hag ar c'helligoù kankr, e c'hall ar metabolitoù bezañ ivez reolennoù dieeun evit brudañ mont war-raok ar c'hrign-bev ha marteze mougañ ar respontoù difenn endogen. An deskrivadur pelloc'h eus perzh fonksionel ar metabolitoù reoliañ-se a c'hellfe digeriñ strategiezhioù all evit gwellaat ar respont emzalc'h enep-tumor.
Skouerioù klañvidi ha roadennoù klinikel a oa bet tapet dre ar sanailh gwiadoù tumor ar c'hrign-bev BC testeniekaet gant ar rouedad sanailhoù gwiadoù kanadian. Hervez ar c'homenad aotreet gant Poellgor Etik Enklask ar C'hrign-bev e BC ha Skol-veur British Columbia (H07-00463), holl skouerennoù ha roadennoù klinikel ar c'hlañvidi o deus tapet asant skrivet pe o deus nac'het o asant ent-ofisiel. Enrollet e vez ar skouerennoù er BioBank testeniekaet (BRC-00290). Diskouezet e vez perzhioù resis ar c'hlañvidi e taolennoù S1 ha S5. Evit ar c'hrioprezervadur e vez implijet ur bistolenn evit distrujañ dre ardivink skouerenn tumor ar c'hlañvour ha goude-se he pouezañ dre ur sil 100 mikron evit kaout ur skorn kellig hepken. Askit ar c'hlañvour a oa bet greizennet da 1500 troatad dre vunutenn e-pad 10 munutenn da 4°C evit pelletañ ar c'helligoù ha tennañ ar surnatant. Ar c'helligoù bet tapet diwar ar c'hrign-bev hag an askit a oa bet miret e 50% a serum AB denel (Sigma-Aldrich), 40% a RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) hag a 10% a dimetil sulfoksid. An distagadurioù kelligoù unvan miret-se a voe teuzet hag implijet evit ar metabolomiezh hag an termenadur metabolit deskrivet amañ dindan.
Ar meziant klok a ya d'ober 0,22 μm silañ 50:50 ouzhpennet gant RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) ouzhpennet gant 10% serum AB denel diweredekaet gant an tommder (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) x1 Penisilin Streptomisin (PenStrep) disoc'h (Thermo Fisher Scientific) ha 50 μMB-merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) a zo ouzhpennet gant 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) ha 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Ar buffer livañ sitometr red a oa savet diwar 0,22 μm holen tamponet gant fosfat silañ (PBS; Invitrogen) ouzhpennet gant 3% a serum denel AB diweredekaet gant an tommder (Sigma). Savet eo ar buffer pinvidikaat kelligoù diwar 0,22 μm PBS silañ ha ouzhpennet gant 0,5% a serum AB denel diweredekaet gant an tommder (Sigma-Aldrich).
E-barzh ur metou klok 37°C e voe livet ar c'helligoù gant 10 nM MT DR ha 100 μM 2-NBDG e-pad 30 munutenn. Goude-se e voe livet ar c'helligoù gant livadur eF506 da 4°C e-pad 15 munutenn. Adlakaat ar c'helligoù e-barzh FC Block (eBioscience) ha Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluiñ e-barzh ur flow cytometer buffer (hervez titouroù ar c'henderc'her), ha gouennañ e-pad 10 munutenn e temperadur ar gambr. Livañ ar c'helligoù gant ur strollad enepkorfoù (Taolenn S2) e-barzh un tampenn livañ dre sitometriezh dre red da 4°C e-pad 20 munutenn. Adlakaat ar c'helligoù e-barzh ur buffer livañ dre sitometriezh dre red (Cytek Aurora; kefluniadur 3L-16V-14B-8R) a-raok an dielfennañ. Implijit SpectroFlo ha FlowJo V10 evit dielfennañ roadennoù niver ar c'helligoù, hag implijit GraphPad Prism 8 evit krouiñ ar roadennoù. Log-normalaet e oa bet kreñvder fluoresañs kreiz (MFI) 2-NBDG ha MT DR, ha goude-se e oa bet implijet un test t par evit an dielfennadur stadegel evit kemer e kont ar c'hlañvidi heñvel. Lemel an holl boblañsoù gant nebeutoc'h eget 40 darvoud diouzh an dielfennadur ; lakait ur werzh MFI a 1 evit kement werzh negativel a-raok ober an dielfennadur stadegel hag ar gweledva roadennoù.
Evit klokaat strategiezh ar c'heflusker dre zorn eus ar banell argerzh meneget a-us, hon eus implijet an notennadur klok gant ar wezenn strishaat stumm (FAUST) (21) evit lakaat kelligoù ent emgefre d'ar boblañs goude bezañ diverket ar c'helligoù marv e FlowJo. Merañ a reomp an disoc'h dre zorn evit kendeuziñ poblañsoù a seblant bezañ rannet fall (o kendeuziñ PD1+ gant kelligoù tumor PD1) ha poblañsoù miret. Pep skouerenn a endalc'h ouzhpenn 2% a gelligoù dre vras, evit un hollad a 11 poblañs.
Implijet e oa bet ar c'hreizennañ gant stankter gradient Ficoll evit dispartiañ PBMC diouzh ar produioù dispartiañ leukosited (STEMCELL Technologies). Dizoloet e voe ar c'helligoù CD8 + T diouzh PBMC dre implijout CD8 MicroBeads (Miltenyi) hag astennet e-barzh ur metou klok dre implijout TransAct (Miltenyi) e-pad 2 sizhunvezh hervez titouroù ar c'henderc'her. Lezet e voe ar c'helligoù da chom e-pad 5 devezh en ur metou klok ennañ IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), ha goude-se e voent adstimulet gant TransAct. D'ar 7vet deiz, hervez titouroù ar c'henderc'her, e voe implijet MicroBeads CD45 denel (Miltenyi) evit pinvidikaat ar c'helligoù e teir dro war-lerc'h. Rannet e oa bet ar c'helligoù evit an dielfennadur dre sitometriezh ar red (evel deskrivet a-us), hag ur milion a gelligoù a oa bet rannet teir gwech evit an dielfennadur LC-MS/MS. Ar skouerennoù a oa bet treuzfurmet dre LC-MS/MS evel deskrivet amañ dindan. Priziet hon eus talvoudegezh ar metabolit mankout gant un niver a ionoù a 1 000. Pep skouerenn a vez normalaet gant an niver hollek a ionoù (TIC), treuzfurmet dre logaritmek ha normalaet ent emgefre e MetaboAnalystR a-raok an dielfennañ.
Dizoloet e voe ar skorn kellig unvan eus pep klañvour ha silañ dre ur sil 40 μm e-barzh ur metou klok (evel deskrivet a-us). Hervez protokol ar c'henderc'her e oa bet implijet teir ront dibab pozitivel war-lerc'h dre zispartiañ perlez magnetek dre implijout MicroBeads (Miltenyi) evit pinvidikaat ar skouerennoù evit ar c'helligoù CD8+, CD4+ ha CD45- (war skorn). E berr gomzoù, adlakaet e vez ar c'helligoù e-barzh ur c'heflusker pinvidikaat ar c'helligoù (evel deskrivet a-us) ha kontet. Goret e voe ar c'helligoù gant perlez CD8 mab-den, perlez CD4 mab-den pe perlez CD45 mab-den (Miltenyi) da 4°C e-pad 15 munutenn, ha goude-se e voent gwalc'het gant tampenn pinvidikaat ar c'helligoù. Tremenet e vez ar skouerenn dre ar golonenn LS (Miltenyi), ha dastumet e vez ar fraksionoù pozitivel ha negativel. Evit digreskiñ an amzer ha kreskiñ ar pazenn adtapout ar c'helligoù e vez implijet ar CD8-fraksion evit an eil tro pinvidikaat CD4+, hag ar CD4-fraksion evit ar CD45-pinvidikaat da heul. Mirout an disoc'h war ar skorn e-pad an argerzh dispartiañ.
Evit prientiñ ar skouerennoù evit an analizañ metabolitoù e voe gwalc'het ar c'helligoù ur wech gant un diluz holen yen-skorn, ha 1 ml a metanol 80% a voe ouzhpennet da bep skouerenn, ha goude-se e voe vortexet ha skornet en nitrogen liñvel. Lakaet e voe ar skouerennoù dindan teir c'helc'hiad skorn-deuz ha greizennañ da 14 000 troatad dre vunutenn e-pad 15 munutenn da 4°C. Ar surnatant a endalc'h ar metabolitoù a vez aezhennet betek ma vo sec'h. Adteuzet e voe ar metabolitoù e 50 μl a asid formek 0,03%, vortexet evit meskañ, ha goude-se greizennet evit tennañ an dilerc'hioù.
Tennañ ar metabolitoù evel deskrivet a-us. Treuzkas ar surnatant en ur voutailh kromatografiezh liñvel uhel evit an enklaskoù war ar metabolomiezh. Implijit ur c'homenad tretañ dre zegouezh evit tretañ pep skouerenn gant un niver heñvel a gelligoù evit mirout ouzh efedoù dre lodenn. Graet hon eus ur priziadenn a-feson eus ar metabolitoù hollek embannet a-raok war ar spektrometr tolz Triple Quadrupole AB SCIEX QTRAP 5500 (50). An analizenn kromatografikel hag an enframmañ gorread pik a oa bet graet gant ar meziant MultiQuant stumm 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Ur c'hont ion a 1000 a oa bet implijet evit priziañ talvoud ar metabolit mankout, ha TIC pep skouerenn a oa bet implijet evit jediñ gorread pik normalaet pep metabolit detektet evit reizhañ ar c'hemmoù degaset gant an dielfennadur binvioù diwar ar c'hefluniadur skouerenn. Goude ma vo normalaet an TIC e vo implijet MetaboAnalystR(51) (arventenn dre ziouer) evit an amdreiñ logaritmek hag ar skalfad linennoù norm emgefre. Implijet hon eus PCA gant pakad R vegan evit ober un dielfennadur ergerzhel eus an diforc'hioù metabolom etre ar seurtoù skouerennoù, hag implijet hon eus un dielfennadur redundañs rannel evit dielfennañ ar c'hlañvidi. Implijit an doare Ward evit sevel un dendrogramm kartenn tommder evit strollañ ar pellder euklidean etre ar skouerennoù. Implijet hon eus limma (52) war ar fonnder metabolitoù skoueriekaet evit anavezout metabolitoù fonnus disheñvel dre ar seurt kelligoù a-bezh hag ar mikroendro. Evit simplaat an displegadenn e implijomp ar perzh keitat strollad evit spisaat ar patrom, ha sellet a reomp ouzh ar seurt kelligoù er mikroendro evel pep strollad (n = 6 strollad); evit an test talvoudegezh hon eus graet teir muzuliadenn a-wechoù evit pep metabolit Evit mirout ouzh an eiladenn faos e oa bet lakaet ar c'hlañvour evel un harz e-barzh tres al limma. Evit gwiriañ an diforc'hioù etre ar metabolitoù etre ar c'hlañvidi disheñvel hon eus kemmet ar patrom limma enni ar c'hlañvidi en un doare termenet. Reiñ a reomp da c'houzout talvoudegezh ar c'hontrol rakspisial etre ar seurt kelligoù hag ar mikroendro Padj <0,05 (reizhadenn Benjamini-Hochberg).
Goude pinvidikaat ar nerzh gant Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% a viabilite), e voe graet ur renkadur treuzskrivom kellig unvan war an ascites bev skornet ha skouerennoù tumor dre implijout ur protokol eztaol 10x 5′gen. Pemp den gant tumoroù hag askites heñvel a oa bet dielfennet, daoust ma oa bet harzet gant ar viabilite izel eus ur skouerenn tumor da vezañ lakaet e-barzh. Evit tizhout meur a zibab klañvidi, hon eus kendeuzet skouerennoù pep klañvour e-barzh hentoù ar c'hontroller krom 10x, hag hon eus dielfennet al lec'hioù askit ha tumor war-eeun. Goude an heuliañ [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genom Kebek ; ur c'hementad a 73 488 ha 41 378 lennadenn dre gellig evit ar c'hrign-bev hag an askited hervez o urzh]], hon eus implijet CellSNP ha Vireo (53) (diazezet war CellSNP evel An SNP denel boutin (VCF) pourvezet gant GRCh38 a zo roet dezhañ un identelezh donezon. Implijout a reomp SNPRelate evit termeniñ an identelezh tostañ (IBS) eus ar genotip klañv (IBS), hep kontañ ar c'helligoù nann-aotreet hag ar c'helligoù anavezet evel duplexoù hag ar skouerioù a glot gant an ascites hag ar skouerennoù tumor (54). (2792 ha 4183 kellig eus ar c'hrign-bev hag eus an ascites, hervez an urzh) evit an dielfennañ. termenet eo ar c'helligoù gant eztaol CD8A ha GZMA, hep kontañ an isstrolladoù gant eztaol protein ribozomek izel.
Dispartiet e voe ar PBMC diouzh ar produioù dispartiañ leukosited (STEMCELL Technologies) dre greizennañ stankter gradient Ficoll. Distagañ a reer ar c'helligoù CD3 + diouzh PBMC dre implijout perlez CD3 (Miltenyi). E-barzh pe hep MNA e veze gweredekaet ar c'helligoù CD3+ gant CD3 stag ouzh ar bladenn (5μg/ml), CD28 dizoloet (3μg/ml) hag IL-2 (300 U/ml; Proleukin). D'an deiz diwezhañ eus an astenn e voe priziet ar vuhezegezh (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) hag ar lieskementadur (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) dre sitometriezh ar red. Priziañ arc'hwel an efedour dre broudañ ar c'helligoù gant PMA (20 ng/ml) hag ionomycin (1μg/ml) gant GolgiStop e-pad 4 eurvezh, ha sellet ouzh CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) ha TNFα-fluoresceinsothianate (TCMA-T4) (TCb1) BD). Broudañ ar c'helligoù qPCR ha ChIP gant PMA (20 ng/ml) hag ionomisin (1μg/ml) e-pad 4 eurvezh. Dastumet e oa bet ar surnatant ELISA a-raok ha goude ar stimuladur gant PMA (20 ng/ml) hag ionomisin (1 μg/ml) e-pad 4 eurvezh.
Heuliañ protokol ar c'henderc'her evit distagañ an ARN dre implijout RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Implijit QIAshredder (QIAGEN) evit homogenizañ ar skouerenn. Implijout ur pakad ARN da cDNA a c'halloud uhel (Thermo Fisher Scientific) evit sintezenniñ TDN kemplezh (cDNA). Implijit TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) evit muzuliañ an eztaol genetek (hervez protokol ar c'henderc'her) gant ar sontennoù da-heul : Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs0042755555S, 2012 Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] ha Hs01010726_m1 (SLC22A2). Ar skouerennoù a oa bet kaset da benn war ar reizhiad PCR amzer-gwirion StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) er bladenn 96 poull optikel buan MicroAmp (Applied Biosystems) gant ur film optikel MicroAmp. Kement talvoud Ct a dremen 35 a vez sellet outañ evel uheloc'h eget ar vevenn detektañ hag a vez merket evel dizoloet.
Ober ChIP evel deskrivet a-raok (58). E berr gomzoù, ar c'helligoù a voe tretet gant formaldehid (kementad diwezhañ 1,42%) ha goret e temperadur ar gambr e-pad 10 munutenn. Implijit un tampenn gontamm ouzhpennet (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl ha 0,1% NP-40) war skorn e-pad 10 munutenn, ha goude-se adlakait en tampon immunopresipitadur evel deskrivet (58 ). Neuze e voe sonikaet ar skouerenn gant ar c'helc'hioù da-heul : 10 kelc'hiad (20 pols 1 eilenn) hag un amzer stabil a 40 eilenn. Enkorfañ an enepkorfoù immunoglobulin G (Teknologiezh sinañ kelligoù; 1μl), histon H3 (Teknologiezh sinañ kelligoù; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) ha SP1 (Teknologiezh sinañ kelligoù; 3μl) gant ar skouerenn da hejañ 4°CC e-pad an noz. Gorviñ perlez protein A (Thermo Fisher Scientific) gant ar skouerenn da 4°C gant hejañ dous e-pad 1 eurvezh, goude-se implijout perlez chelex (Bio-Rad) evit pinvidikaat an TDN, hag implijout proteinaz K (Thermo Fisher) evit digeriñ ar protein. Detektet e oa bet ar promoter TNFα dre PCR : war-raok, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT ; er c'hontrol, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp produ). Produet e oa bet ar skeudennoù gant Image Lab (Bio-Rad) ha muzuliet e oa bet gant ar meziant ImageJ.
Dastumet e oa bet ar supernatant sevenadur kelligoù evel deskrivet a-us. Graet e oa bet an termenadur hervez argerzhioù ar c'henderc'her eus ar pakad ELISA TNFα denel (Invitrogen), ar pakad ELISA IL-2 denel (Invitrogen) hag ar pakad ELISA IFN-γ denel (Abcam). Hervez protokol ar c'henderc'her e oa bet diluet ar surnatant 1:100 evit detektiñ TNFα hag IL-2, ha 1:3 evit detektiñ IFN-γ. Implijit EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) evit muzuliañ an absorbañs da 450 nm.
Dispartiet e voe ar PBMC diouzh ar produioù dispartiañ leukosited (STEMCELL Technologies) dre greizennañ stankter gradient Ficoll. Distagañ a reer ar c'helligoù CD3 + diouzh PBMC dre implijout perlez CD3 (Miltenyi). E-barzh pe hep MNA e veze gweredekaet ar c'helligoù CD3+ gant CD3 stag ouzh ar bladenn (5μg/ml), CD28 dizoloet (3μg/ml) hag IL-2 (300 U/ml; Proleukin) e-pad 3 devezh. Goude 3 devezh e voe dastumet ar c'helligoù ha gwalc'het gant 0,9% holen, ha skornet e voe ar pellet. Ar c'hontadennoù kelligoù a oa bet graet dre sitometriezh dre red (Cytek Aurora; kefluniadur 3L-16V-14B-8R) en ur implijout eBeads 123count.
Tennañ ar metabolitoù evel deskrivet a-us. Adkempennet e voe an tenn sec'h gant ur c'hementad a 4000 kevatal kellig/μl. Dielfennañ ar skouerenn dre gromatografiezh fazennoù enep (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ha kolonenn CORTECS T3 (2,1×150 mm, ment ar rannigoù 1,6-μm, ment ar poroù 120-Å; #186008500, Waters). Spektrometr tolz polarel (6470, Agilent), ma vez oberiant an ionizadur dre elektro-spray e mod pozitivel. Ar fazenn heloc'h A a zo 0,1% asid formek (e H2O), ar fazenn heloc'h B a zo 90% asetonitril, 0,1% asid formek. Ar gradient LC a zo 0 da 2 vunutenn evit 100% A, 2 da 7,1 munutenn evit 99% B, ha 7,1 da 8 munutenn evit 99% B. Goude-se adkempennet ar bann gant ar fazenn luc'hskeudenniñ A gant ur feur red a 0,6 ml/munutenn e-pad 3 vunutenn. . 0,4ml/min eo ar feur red, ha tommet eo kambr ar c'holonenn betek 50°C. Implijit ar standard kimiek glan MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) evit termeniñ an amzer dalc'h (RT) hag an treuzfurmadur (RT = 0,882 munutenn, treuzfurmadur 1 = 137→94,1, treuzfurmadur 2 = 137→92 , Treuzfurmadur = 13→787). Pa c'hoarvez an tri tremen d'an amzer dalc'h reizh e vez implijet an tremen 1 evit ar c'hantaouiñ evit gwarantiñ ar spesadelezh. Ar c'hrommenn skoueriek eus MNA (Toronto Research Chemical Company) a oa bet krouet dre c'hwec'h diluziadur en heuliad eus an disoc'h stok (1 mg/ml) evit kaout skouerioù 0,1, 1,0, 10 ha 100 ng/ml ha 1,0 ha 10μg/ml liñvel hervez an urzh. ng/ml eo ar vevenn detektañ, hag etre 10 ng/ml ha 10 μg/ml eo ar respont linennek. Pep ensinkladenn daou vikrolitrad skouerenn ha standard a vez implijet evit an dielfennadur LC/MS, hag ur skouerenn kontroll kalite mesket a vez kaset da benn bep eizh ensinkladenn evit gwarantiñ stabilded ar bladenn dielfennañ. Respontoù MNA an holl skouerennoù kelligoù tretet gant MNA a oa e-barzh rann linennek an analizenn. An analizenn roadennoù a oa bet graet gant ar meziant MassHunter (v9.0, Agilent).
Tennet eo bet ar sevel αFR-CAR eil remziad digant Song et al. (59). E berr gomzoù, ar savadur a endalc'h an endalc'hadoù da-heul : heuliad pennañ CD8a, tamm argemm chadenn unvan spesadel αFR mab-den, charnier CD8a ha rannvro treuzmembranek, domani diabarzh CD27 ha domani diabarzh kellig CD3z. Sintezet e oa bet an heuliad CAR klok gant GenScript, ha klonet goude-se e-barzh ar vektor eztaol lentivirus eil remziad a-us d'ar c'hasetenn eztaol GFP implijet evit priziañ efedusted an treuzkas.
Produet e vez al lentivirus dre dreuzfeurmiñ kelligoù HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); kresket e metoù Eagle kemmet Dulbecco ennañ 10% serum bovin fetal (FBS) ha 1% PenStrep, hag implijet vektor CAR-GFP ha Ar plasmidoù pakañ (psPAX2 ha pMD2.G, Addgene) a implij lipofection amine (Sigma-Aldrich). Dastumet e voe ar surnatant ennañ virus 48 ha 72 eurvezh goude an treuzfeurmiñ, silet ha strollet dre ultrasentrifugadur. Mirout ar surnatant viral kenstrollet da -80°C betek an treuzkas.
Dispartiet e vez ar PBMC diouzh ar produioù dispartiañ leukosited donezonerien yac'h (STEMCELL Technologies) dre greizennañ stankter gradient Ficoll. Implijit mikroperlennoù CD8 dibab pozitivel (Miltenyi) evit distagañ ar c'helligoù CD8+ diouzh PBMC. Broudañ ar c'helligoù T gant TransAct (Miltenyi) hag e metou TexMACS [Miltenyi; ouzhpennet gant 3% serum denel diweredekaet gant an tommder, 1% PenStrep hag IL-2 (300 U/ml)]. Pevar eurvezh warn-ugent goude ar stimuladur e voe treuzkaset ar c'helligoù T gant lentivirus (10 μl dreist-virus kreñvaet dre 106 kellig). 1 pe 3 devezh goude an treuzkas war Cytek Aurora (war FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), priziañ eztaol GFP ar c'helligoù evit diskouez un efedusted treuzkas a 30% da nebeutañ.
Sevenet e voe ar c'helligoù CAR-T e-pad 24 eurvezh en Immunocult (STEMCELL Technologies; ouzhpennet gant 1% PenStrep) dindan an doareoù da-heul : hep bezañ tretet, tretet gant 250 μM adenozin pe 10 mM MNA. Goude ar pretretañ e voe gwalc'het ar c'helligoù CAR-T gant PBS ha kendeuzet gant 20 000 kellig SK-OV-3 [ATCC; e-barzh ur metou McCoy 5A (Sigma-Aldrich) ouzhpennet gant 10% FBS ha 1% PenStrep da 10 : Kreñvaet e oa bet ar feur efedour-tarzh 1 e teir gwech e-barzh ur metou Immunocult ouzhpennet. Ar c'helligoù SK-OV-3 hag ar c'helligoù SK-OV-3 lizet gant saponin digitalis (0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) a voe implijet evel kontrolloù negativel ha pozitivel, hervez an urzh. Goude 24 eurvezh kenlabour e voe dastumet ar surnatant ha muzuliet e voe al laktat dehidrogenaz (LDH) hervez titouroù ar c'henderc'her (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Diluet e oa bet ar surnatant LDH 1:50 e tampenn LDH. Muzuliañ a reer ar feur lazhañ dre ar formulenn-mañ : dregantad lazhañ = dregantad reizhañ / feur lazhañ uhelañ x 100%, ma dregantad reizhañ = kensevenadur-kelligoù T hepken, ha feur lazhañ uhelañ = kontroll pozitivel-kontroll negativel.
Evel deskrivet en destenn pe en dafar hag en doareoù, implijit GraphPad Prism 8, Microsoft Excel pe R v3.6.0 evit an dielfennadur stadegel. Ma vez dastumet meur a skouerenn eus ar memes klañvour (evel an askit hag an tumor), e implijomp un test t par pe e lakaomp ar c'hlañvour evel un efed dre zegouezh en ur patrom linennek pe hollek hervez ar c'hoant. Evit an dielfennadur metabolomek e vez graet an test pouez e teir skouerenn.
Evit kaout dafar ouzhpenn evit ar pennad-mañ, kit da welet http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ur pennad digor eo, skignet dindan termenoù an aotre-implijout Creative Commons Attribution-Non-Commercial, hag a aotre an implij, an dasparzh hag an adkempenn e forzh peseurt meziant, keit ha ma n'eo ket evit gounid armerzhel an implij diwezhañ ha ma'z eo reizh al labour orin. Dave.
Evezhiadenn : Goulenn a reomp diganeoc'h reiñ ho chomlec'h postel nemet evit ma ouezo an hini a ginnigit war ar bajenn e fell deoc'h e vefe gwelet ar postel gantañ ha n'eo ket spam. Ne vo ket tapet chomlec'h postel ebet ganeomp.
Implijet e vez ar goulenn-mañ evit gwiriañ hag-eñ oc'h ur weladenner ha mirout ouzh an enporzhiañ stroboù ent emgefre.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.R. Bellnis), Dephraldi. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA a gemer perzh e mougañ ar c'helligoù T hag a zo ur pal imunoterapiezh a c'hallfe bezañ evit tretañ ar c'hrign-bev denel.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.R. Bellnis), Dephraldi. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA a gemer perzh e mougañ ar c'helligoù T hag a zo ur pal imunoterapiezh a c'hallfe bezañ evit tretañ ar c'hrign-bev denel.
©2021 Kevredigezh Amerikan evit Araokaat ar Skiantoù. an holl wirioù miret. AAAS zo ur c'hevread eus HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ha COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.